PARP‐3 associates with polycomb group bodies and with components of the DNA damage repair machinery
Michèle RouleauDarin McDonaldP GagnéM.‐E. OuelletArnaud DroitJoanna M. HunterS. DutertreClaude PrigentMichael J. HendzelGuy G. Poirier
112
Citation
57
Reference
10
Related Paper
Citation Trend
Abstract:
Abstract Poly(ADP‐ribose) polymerase 3 (PARP‐3) is a novel member of the PARP family of enzymes that synthesize poly(ADP‐ribose) on themselves and other acceptor proteins. Very little is known about this PARP, which is closely related to PARP‐1 and PARP‐2. By sequence analysis, we find that PARP‐3 may be expressed in two isoforms which we studied in more detail to gain insight into their possible functions. We find that both PARP‐3 isoforms, transiently expressed as GFP or FLAG fusions, are nuclear. Detection of endogenous PARP‐3 with a specific antibody also shows a widespread nuclear distribution, appearing in numerous small foci and a small number of larger foci. Through co‐localization experiments and immunoprecipitations, the larger nuclear foci were identified as Polycomb group bodies (PcG bodies) and we found that PARP‐3 is part of Polycomb group protein complexes. Furthermore, using a proteomics approach, we determined that both PARP‐3 isoforms are part of complexes comprising DNA‐PKcs, PARP‐1, DNA ligase III, DNA ligase IV, Ku70, and Ku80. Our findings suggest that PARP‐3 is a nuclear protein involved in transcriptional silencing and in the cellular response to DNA damage. J. Cell. Biochem. 100: 385–401, 2007. © 2006 Wiley‐Liss, Inc.Keywords:
Ku70
Ku80
Abstract Non-homologous end joining (NHEJ) plays a major role in repairing DNA double-strand breaks (DSBs) and is key to genome stability and editing. The minimal core NHEJ proteins, namely Ku70, Ku80, DNA ligase IV and XRCC4, are conserved, but other factors vary in different eukaryotes groups. In plants, known NHEJ proteins are the core factors only, and the molecular mechanism of plant NHEJ remains unclear. Here, we report a previously unidentified plant ortholog of PAXX, the crystal structure of which showed a similar fold to human PAXX. However, plant PAXX has similar molecular functions to human XLF, by directly interacting with Ku70/80 and XRCC4. This suggests that plant PAXX combines the roles of mammalian PAXX and XLF and that these functions merged into a single protein during evolution. This is consistent with a redundant function of PAXX and XLF in mammals.
Ku70
Ku80
Non-homologous end joining
Cite
Citations (1)
Τα Μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) αποτελούν ετερογενή ομάδα διαταραχών του αρχέγονου πολυδύναμου αιμοποιητικού κυττάρου χαρακτηριζόμενα από γενετική αστάθεια, .που κατά ένα μέρος σχετίζεται σε μοριακό επίπεδο με διαταραχές στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA. Η επιδιόρθωση των θραυσμάτων διπλής έλικας (DSB) γίνεται με δύο μηχανισμούς: Ηοmologous Recombination (HR) και Νon Homologous End Joining (NHEJ) με κυρίαρχο ρόλο στα ανώτερα θηλαστικά. O NHEJ μηχανισμός εξαρτάται από παράγοντες όπως τις δύο υποομάδες της πρωτεΐνης Ku (Ku70/Ku80), την πρωτεϊνική κινάση DNA-PKcs, και την πρωτεΐνη XRCC4 που ενεργοποιεί τη DNA ligase IV για την επανασύνδεση των θραυσμάτων. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ποιοτική και ποσοτική ανίχνευση των επιμέρους πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο μηχανισμό NHEJ, καθώς και ο προσδιορισμός της δραστηριότητας του μηχανισμού στα κύτταρα μυελού των οστών ασθενών με νεοδιαγνωσθέν πρωτοπαθές ΜΔΣ. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 48 ασθενείς με πρωτοπαθές μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο. Η ανάλυση της έκφρασης των ενζύμων που συμμετέχουν στο μηχανισμό NHEJ έγινε με τη μέθοδο αποτύπωσης κατά Western. Οι πρωτεΐνες που μελετήθηκαν είναι οι ακόλουθες:Ku70, Ku80, DNA-PKcs, XRCC4, Ligase IV. Τα ευρήματα της αποτύπωσης κατά Western επιβεβαιώθηκαν με διπλή ανοσοϊστοχημική μελέτη. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της δραστηριότητας NHEJ σε εκχυλίσματα κυττάρων CD34+ από μυελό των οστών ενός μέρους του συνόλου των ασθενών. Η διεργασία αυτή έγινε με την εισαγωγή τους στα κατάλληλα πλασμίδια, πολλαπλασιασμό τους με τη μέθοδο Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης (PCR amplification) , πέψη του DNA με διάφορα περιοριστικά ένζυμα, και σύγκριση του προτύπου των παραγομένων ζωνών με το φυσιολογικό πρότυπο που αναμένεται σε ακεραιότητα της λειτουργίας του μηχανισμού NHEJ. Η μέση τιμή έκφρασης της πρωτεΐνης Ligase IV βρέθηκε να είναι στατιστικώς σημαντικά χαμηλότερη στους ασθενείς με ΜΔΣ σε σχέση με τους μάρτυρες (0,53 αντί 0,78, p=0,036). Παρατηρήθηκε μια θετική συσχέτιση μεταξύ των τιμών έκφρασης της πρωτεΐνης Ku70 και του ποσοστού των βλαστών σε στατιστικώς σημαντικό βαθμό (p= 0,04). Αντιθέτως, βρέθηκε αρνητική συσχέτιση ανάμεσα στα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Ku80 και του ποσοστού των βλαστών, σε βαθμό που πλησίασε το όριο στατιστικής σημαντικότητας (p= 0,07). Επιπλέον, σημειώθηκε στατιστικώς σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ των τιμών έκφρασης του ενζύμου Ku70 και των επιπέδων αιμοσφαιρίνης (p=0,05). Επιπροσθέτως, παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τιμών έκφρασης της Ligase IV και της ομάδας καρυοτύπου, αναδεικνύοντας ότι ασθενείς με υψηλότερη τιμή Ligase IV είχαν καρυότυπο καλής πρόγνωσης (p=0,05.) Αντιθέτως, όσον αφορά το ένζυμο Ku70, τα επίπεδα έκφρασης ήταν χαμηλότερα σε ασθενείς με καρυότυπο καλής πρόγνωσης, σε στατιστικώς σημαντικό βαθμό (p=0,04). Παρόμοιο φαινόμενο παρατηρήθηκε και στις ομάδες IPSS (p=0,07). Όσον αφορά στον έλεγχο της ακεραιότητας του NHEJ, όλα τα δείγματα ασθενών ΜΔΣ που ελέγχθηκαν για την ακεραιότητα του μηχανισμού εμφάνισαν ορθή επανένωση της βλάβης, δηλαδή ακέραιο μηχανισμό. Επιπλέον, δε διέφεραν από τους μάρτυρες, οι οποίοι παρουσίασαν το ίδιο μοντέλο επανένωσης. Από όσο είμαστε σε θέση να γνωρίζουμε, η μελέτη μας αποτελεί την πρώτη μελέτη που διερευνά το ρόλο του μηχανισμού NHEJ στην παθογένεση των ΜΔΣ σε επίπεδο πρωτεϊνών καθώς και η πρώτη που εξετάζει την ακεραιότητα του μηχανισμού ως σύνολο στα ΜΔΣ. Βρήκαμε, για πρώτη φορά, ότι η έκφραση της πρωτεΐνης Ligase IV είναι χαμηλότερη στους ασθενείς με ΜΔΣ σε σχέση με τους μάρτυρες σε στατιστικώς σημαντικό βαθμό. Επίσης, για πρώτη φορά αναδεικνύουμε συσχέτιση της πρωτεΐνης Ku70 με πιο επιθετική νόσο. Περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου των μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA στην παθογένεση των ΜΔΣ κρίνεται απαραίτητη.
Ku70
Ku80
Non-homologous end joining
Cite
Citations (0)
Non-homologous end-joining (NHEJ) is a major mechanism for repairing DNA double strand breaks in mammalian cells. Six ‘core’ NHEJ components have been identified to date: Ku70, Ku80, the DNA dependent protein kinase catalytic subunit DNA-PKcs, DNA ligase IV, XRCC4, and XLF-Cemunnos. In this thesis, the DNA binding properties of the Ku70/80 heterodimer are characterised by means of fluorescence anisotropy and electrophoretic mobility shift assays. Studies with duplexes holding 1, 2 or 3 heterodimers allowed to develop a binding model that can be applied to analyse the interactions of Ku with duplexes of any length. In addition, salt dependent studies indicate that electrostatic interactions play a major role in the binding of Ku to nucleic acids. The interaction of the Ku heterodimer with the DNA ligase IV/XRCC4 (LX) complex and the role of DNA-PKcs in regulating the NHEJ complex
assembly are investigated. Protein-protein interaction experiments show that Ku interacts with DNA ligase IV via its tandem BRCT domain and this interaction is enhanced by the presence of XRCC4 and DNA. In particular, mutagenesis studies indicate that residues 643-748 encompassing the first BRCT domain of DNA ligase IV are necessary for binding. Moreover, Ku needs to be in its heterodimeric form to bind LX and the C-terminal of Ku80 is dispensable for this interaction. The presence of DNA-PKcs favours the interaction between Ku and LX, although its kinase activity induces the disassembly of the complex. Finally, the interaction of Ku with other factors potentially involved in NHEJ such as the replication protein A, PARP-1, and the WRN helicase is investigated. Collectively, these findings provide novel information on the macromolecular interactions that regulate the NHEJ pathway.
Ku80
Ku70
Non-homologous end joining
DNA polymerase mu
Cite
Citations (0)
The classical nonhomologous end-joining (C-NHEJ) DNA double-strand break (DSB) repair pathway employs the Ku70/80 complex (Ku) for DSB recognition and the XRCC4/DNA ligase 4 (Lig4) complex for ligation. During IgH class switch recombination (CSR) in B lymphocytes, switch (S) region DSBs are joined by C-NHEJ to form junctions either with short microhomologies (MHs; "MH-mediated" joins) or no homologies ("direct" joins). In the absence of XRCC4 or Lig4, substantial CSR occurs via "alternative" end-joining (A-EJ) that generates largely MH-mediated joins. Because upstream C-NHEJ components remain in XRCC4- or Lig4-deficient B cells, residual CSR might be catalyzed by C-NHEJ using a different ligase. To address this, we have assayed for CSR in B cells deficient for Ku70, Ku80, or both Ku70 and Lig4. Ku70- or Ku80-deficient B cells have reduced, but still substantial, CSR. Strikingly, B cells deficient for both Ku plus Lig4 undergo CSR similarly to Ku-deficient B cells, firmly demonstrating that an A-EJ pathway distinct from C-NHEJ can catalyze CSR end-joining. Ku-deficient or Ku- plus Lig4-deficient B cells are also biased toward MH-mediated CSR joins; but, in contrast to XRCC4- or Lig4-deficient B cells, generate substantial numbers of direct CSR joins. Our findings suggest that more than one form of A-EJ can function in CSR.
Ku80
Ku70
Non-homologous end joining
Cite
Citations (182)
ABSTRACT The Ku antigen is a heteromeric (Ku70/Ku80), mostly nuclear protein. Ku participates in multiple nuclear processes from DNA repair to V(D)J recombination to telomere maintenance to transcriptional regulation and serves as a DNA binding subunit and allosteric regulator of DNA-dependent protein kinase. While some evidence suggests that subcellular localization of Ku may be subject to regulation, how Ku gains access to the nucleus is poorly understood. In this work, using a combination of indirect immunofluorescence and direct fluorescence, we have demonstrated that transfer of the Ku heterodimer to the nucleus is determined by basic nuclear localization signals in each of the Ku subunits that function independently. A bipartite basic nuclear localization signal between amino acids 539-556 of Ku70 was observed to be required for nuclear import of full-length Ku70 monomer, while a short Ku80 motif of four amino acids from 565-568 containing three lysines was required for the nuclear import of full- length Ku80. Ku heterodimers containing only one nuclear localization signal accumulated in the nucleus as efficiently as wild-type Ku, while site directed mutagenesis inactivating the basic motifs in each subunit, resulted in a Ku heterodimer that was completely localized to the cytoplasm. Lastly, our results indicate that mutations in Ku previously proposed to abrogate Ku70/Ku80 heterodimerization, markedly reduced the accumulation of Ku70 without affecting heterodimer formation in mammalian cells.
Ku80
Ku70
Cite
Citations (31)
Ku80
Ku70
DNA-PKcs
Non-homologous end joining
DNA polymerase mu
DDB1
Cite
Citations (0)
Ku70
Ku80
Non-homologous end joining
DNA-PKcs
Cite
Citations (29)
Ku70
Ku80
Non-homologous end joining
DNA-PKcs
Cite
Citations (0)
Ku80
Ku70
NLS
Nuclear pore
Telophase
Importin
Cite
Citations (69)
Ku70
Ku80
Non-homologous end joining
DNA-PKcs
Cite
Citations (0)