Ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων που ελέγχουν τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA στα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα
0
Citation
0
Reference
10
Related Paper
Abstract:
Τα Μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) αποτελούν ετερογενή ομάδα διαταραχών του αρχέγονου πολυδύναμου αιμοποιητικού κυττάρου χαρακτηριζόμενα από γενετική αστάθεια, .που κατά ένα μέρος σχετίζεται σε μοριακό επίπεδο με διαταραχές στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA. Η επιδιόρθωση των θραυσμάτων διπλής έλικας (DSB) γίνεται με δύο μηχανισμούς: Ηοmologous Recombination (HR) και Νon Homologous End Joining (NHEJ) με κυρίαρχο ρόλο στα ανώτερα θηλαστικά. O NHEJ μηχανισμός εξαρτάται από παράγοντες όπως τις δύο υποομάδες της πρωτεΐνης Ku (Ku70/Ku80), την πρωτεϊνική κινάση DNA-PKcs, και την πρωτεΐνη XRCC4 που ενεργοποιεί τη DNA ligase IV για την επανασύνδεση των θραυσμάτων. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ποιοτική και ποσοτική ανίχνευση των επιμέρους πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο μηχανισμό NHEJ, καθώς και ο προσδιορισμός της δραστηριότητας του μηχανισμού στα κύτταρα μυελού των οστών ασθενών με νεοδιαγνωσθέν πρωτοπαθές ΜΔΣ. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 48 ασθενείς με πρωτοπαθές μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο. Η ανάλυση της έκφρασης των ενζύμων που συμμετέχουν στο μηχανισμό NHEJ έγινε με τη μέθοδο αποτύπωσης κατά Western. Οι πρωτεΐνες που μελετήθηκαν είναι οι ακόλουθες:Ku70, Ku80, DNA-PKcs, XRCC4, Ligase IV. Τα ευρήματα της αποτύπωσης κατά Western επιβεβαιώθηκαν με διπλή ανοσοϊστοχημική μελέτη. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της δραστηριότητας NHEJ σε εκχυλίσματα κυττάρων CD34+ από μυελό των οστών ενός μέρους του συνόλου των ασθενών. Η διεργασία αυτή έγινε με την εισαγωγή τους στα κατάλληλα πλασμίδια, πολλαπλασιασμό τους με τη μέθοδο Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης (PCR amplification) , πέψη του DNA με διάφορα περιοριστικά ένζυμα, και σύγκριση του προτύπου των παραγομένων ζωνών με το φυσιολογικό πρότυπο που αναμένεται σε ακεραιότητα της λειτουργίας του μηχανισμού NHEJ. Η μέση τιμή έκφρασης της πρωτεΐνης Ligase IV βρέθηκε να είναι στατιστικώς σημαντικά χαμηλότερη στους ασθενείς με ΜΔΣ σε σχέση με τους μάρτυρες (0,53 αντί 0,78, p=0,036). Παρατηρήθηκε μια θετική συσχέτιση μεταξύ των τιμών έκφρασης της πρωτεΐνης Ku70 και του ποσοστού των βλαστών σε στατιστικώς σημαντικό βαθμό (p= 0,04). Αντιθέτως, βρέθηκε αρνητική συσχέτιση ανάμεσα στα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Ku80 και του ποσοστού των βλαστών, σε βαθμό που πλησίασε το όριο στατιστικής σημαντικότητας (p= 0,07). Επιπλέον, σημειώθηκε στατιστικώς σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ των τιμών έκφρασης του ενζύμου Ku70 και των επιπέδων αιμοσφαιρίνης (p=0,05). Επιπροσθέτως, παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τιμών έκφρασης της Ligase IV και της ομάδας καρυοτύπου, αναδεικνύοντας ότι ασθενείς με υψηλότερη τιμή Ligase IV είχαν καρυότυπο καλής πρόγνωσης (p=0,05.) Αντιθέτως, όσον αφορά το ένζυμο Ku70, τα επίπεδα έκφρασης ήταν χαμηλότερα σε ασθενείς με καρυότυπο καλής πρόγνωσης, σε στατιστικώς σημαντικό βαθμό (p=0,04). Παρόμοιο φαινόμενο παρατηρήθηκε και στις ομάδες IPSS (p=0,07). Όσον αφορά στον έλεγχο της ακεραιότητας του NHEJ, όλα τα δείγματα ασθενών ΜΔΣ που ελέγχθηκαν για την ακεραιότητα του μηχανισμού εμφάνισαν ορθή επανένωση της βλάβης, δηλαδή ακέραιο μηχανισμό. Επιπλέον, δε διέφεραν από τους μάρτυρες, οι οποίοι παρουσίασαν το ίδιο μοντέλο επανένωσης. Από όσο είμαστε σε θέση να γνωρίζουμε, η μελέτη μας αποτελεί την πρώτη μελέτη που διερευνά το ρόλο του μηχανισμού NHEJ στην παθογένεση των ΜΔΣ σε επίπεδο πρωτεϊνών καθώς και η πρώτη που εξετάζει την ακεραιότητα του μηχανισμού ως σύνολο στα ΜΔΣ. Βρήκαμε, για πρώτη φορά, ότι η έκφραση της πρωτεΐνης Ligase IV είναι χαμηλότερη στους ασθενείς με ΜΔΣ σε σχέση με τους μάρτυρες σε στατιστικώς σημαντικό βαθμό. Επίσης, για πρώτη φορά αναδεικνύουμε συσχέτιση της πρωτεΐνης Ku70 με πιο επιθετική νόσο. Περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου των μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA στην παθογένεση των ΜΔΣ κρίνεται απαραίτητη.Keywords:
Ku70
Ku80
Non-homologous end joining
Abstract Non-homologous end joining (NHEJ) plays a major role in repairing DNA double-strand breaks (DSBs) and is key to genome stability and editing. The minimal core NHEJ proteins, namely Ku70, Ku80, DNA ligase IV and XRCC4, are conserved, but other factors vary in different eukaryotes groups. In plants, known NHEJ proteins are the core factors only, and the molecular mechanism of plant NHEJ remains unclear. Here, we report a previously unidentified plant ortholog of PAXX, the crystal structure of which showed a similar fold to human PAXX. However, plant PAXX has similar molecular functions to human XLF, by directly interacting with Ku70/80 and XRCC4. This suggests that plant PAXX combines the roles of mammalian PAXX and XLF and that these functions merged into a single protein during evolution. This is consistent with a redundant function of PAXX and XLF in mammals.
Ku70
Ku80
Non-homologous end joining
Cite
Citations (1)
Ku80
Ku70
Non-homologous end joining
Telomere-binding protein
Cite
Citations (292)
DNA double-strand break (DSB) repair by nonhomologous end joining (NHEJ) requires the assembly of several proteins on DNA ends. Although biochemical studies have elucidated several aspects of the NHEJ reaction mechanism, much less is known about NHEJ in living cells, mainly because of the inability to visualize NHEJ repair proteins at DNA damage. Here we provide evidence that a pulsed near IR laser can produce DSBs without any visible alterations in the nucleus, and we show that NHEJ proteins accumulate in the irradiated areas. The levels of DSBs and Ku accumulation diminished in time, showing that this approach allows us to study DNA repair kinetics in vivo . Remarkably, the Ku heterodimers on DNA ends were in dynamic equilibrium with Ku70/80 in solution, showing that NHEJ complex assembly is reversible. Accumulation of XRCC4/ligase IV on DSBs depended on the presence of Ku70/80, but not DNA-PK CS . We detected a direct interaction between Ku70 and XRCC4 that could explain these requirements. Our results suggest that this assembly constitutes the core of the NHEJ reaction and that XRCC4 may serve as a flexible tether between Ku70/80 and ligase IV.
Ku70
Ku80
Non-homologous end joining
Cite
Citations (386)
The classical nonhomologous end-joining (C-NHEJ) DNA double-strand break (DSB) repair pathway employs the Ku70/80 complex (Ku) for DSB recognition and the XRCC4/DNA ligase 4 (Lig4) complex for ligation. During IgH class switch recombination (CSR) in B lymphocytes, switch (S) region DSBs are joined by C-NHEJ to form junctions either with short microhomologies (MHs; "MH-mediated" joins) or no homologies ("direct" joins). In the absence of XRCC4 or Lig4, substantial CSR occurs via "alternative" end-joining (A-EJ) that generates largely MH-mediated joins. Because upstream C-NHEJ components remain in XRCC4- or Lig4-deficient B cells, residual CSR might be catalyzed by C-NHEJ using a different ligase. To address this, we have assayed for CSR in B cells deficient for Ku70, Ku80, or both Ku70 and Lig4. Ku70- or Ku80-deficient B cells have reduced, but still substantial, CSR. Strikingly, B cells deficient for both Ku plus Lig4 undergo CSR similarly to Ku-deficient B cells, firmly demonstrating that an A-EJ pathway distinct from C-NHEJ can catalyze CSR end-joining. Ku-deficient or Ku- plus Lig4-deficient B cells are also biased toward MH-mediated CSR joins; but, in contrast to XRCC4- or Lig4-deficient B cells, generate substantial numbers of direct CSR joins. Our findings suggest that more than one form of A-EJ can function in CSR.
Ku80
Ku70
Non-homologous end joining
Cite
Citations (182)
BRCA1 ensures genomic stability, at least in part, through a functional role in DNA damage repair. BRCA1 interacts with the Rad50/Mre11/Nbs1 complex that occupies a central role in DNA double-strand break repair mediated by homologous recombination and nonhomologous end joining (NHEJ). NHEJ can be catalyzed by mammalian whole cell extract in a reaction dependent upon DNA ligase IV, Xrcc4, Ku70, Ku80, and DNA-PKcs. Here, we show that under identical cell-free reaction conditions, the addition of antibodies specific for BRCA1 and Rad 50 but not Rad51, inhibits end-joining activity. Cell extracts derived from Brca1-deficient mouse embryonic fibroblasts exhibit reduced end-joining activity independent of the endogenous protein amounts of DNA ligase IV, Ku80, and Ku70. The Brca1-dependent NHEJ activity predominates at the lower concentrations of Mg2+ (0.5 mM); elevated Mg2+ or Mn2+ concentrations (10 mM) dramatically increase overall end-joining activity and abrogates the requirement for Brca1, Xrcc4, and Ku70. The addition of partially purified BRCA1, in association with Rad50/Mre11/Nbs1 complex, complements the NHEJ deficiency of Brca1-null fibroblast extracts. These results suggest a role for Brca1 in NHEJ and in the maintenance of genome integrity.
Ku70
Ku80
Non-homologous end joining
Rad50
Cite
Citations (133)
Ku70
Ku80
Non-homologous end joining
DNA-PKcs
Cite
Citations (29)
Ku80
Ku70
Non-homologous end joining
DNA-PKcs
DNA polymerase mu
DDB1
Cite
Citations (61)
Ku70
Ku80
Non-homologous end joining
DNA-PKcs
Cite
Citations (0)
Non-homologous end joining (NHEJ) is a major DNA double-strand break (DSB) repair pathway that functions in all phases of the cell cycle. NHEJ repairs genotoxic and physiological DSBs, such as those generated by ionizing radiation and during V(D)J recombination at antigen receptor loci, respectively. DNA end joining by NHEJ relies on the core factors Ku70, Ku80, XRCC4, and DNA Ligase IV. Additional proteins also play important roles in NHEJ. The XRCC4-like factor (XLF) participates in NHEJ through its interaction with XRCC4, and XLF deficiency in humans leads to immunodeficiency and increased sensitivity to ionizing radiation. However, XLF is dispensable for NHEJ-mediated DSB repair during V(D)J recombination in murine lymphocytes, where it may have redundant functions with other DSB repair factors. Paralog of XRCC4 and XLF (PAXX) is a recently identified NHEJ factor that has structural similarity to XRCC4 and XLF. Here we show that PAXX is also dispensable for NHEJ during V(D)J recombination and during the repair of genotoxic DSBs in lymphocytes. However, a combined deficiency of PAXX and XLF blocks NHEJ with a severity comparable to that observed in DNA Ligase IV-deficient cells. Similar to XLF, PAXX interacts with Ku through its C-terminal region, and mutations that disrupt Ku binding prevent PAXX from promoting NHEJ in XLF-deficient lymphocytes. Our findings suggest that the PAXX and XLF proteins may have redundant functions during NHEJ.
Ku80
Non-homologous end joining
Ku70
V(D)J recombination
Cite
Citations (47)
DNA double-strand breaks (DSBs) are a common form of DNA damage and double-strand break rejoining is a fundamental mechanism of genome protection to prevent chromosomal fragmentation, translocation and deletions. DSBs may be induced by exogenous agents, such as ionizing radiation, but also occur spontaneously during cellular processes e.g. in the rearrangement of gene segments during V(D)J [variable (V), diversity (D), joining (J)] recombination. The ge-nomic instability resulting from incorrectly repaired DSBs can lead to carcinogenesis, while unrepaired may carry on even to cell death. To repair this potentially lethal damage cells developed several different types of repair act on the DSBs e.g. homologous recombination repair (HRR), non-homologous DNA end joining (NHEJ), and single-strand annealing (SSA).The most essential in mammalian cells is NHEJ, whereas HRR and SSA significantly contributes to DSBs repair in lower eukaryotes. At least six distinct proteins are known to be required for NHEJ, i ncluding Ku70, Ku80, DNA-PKcs, XRCC4, DNA ligase IV, and Artemis. In this review we highlight classical and up-to-date aspects and present understanding of the molecular mechanisms of NHEJ in the maintenance of genome integrity. Keywords: Non-homologous DNA end joining, NHEJ, DNA double-strand breaks repair, DNA-PK, DNA-PKcs, Ku70, Ku80, XRCC4, ligase IV, Artemis
Ku70
Ku80
Non-homologous end joining
Cite
Citations (1)