Extinction and reinstatement of methamphetamine‐induced conditioned place preference in zebrafish
4
Citation
39
Reference
10
Related Paper
Citation Trend
Abstract:
Abstract Conditioned place preference (CPP) paradigm in zebrafish has been used to measure drug reward, but there is limited research on CPP reinstatement to determine relapse vulnerability. The present study aimed to investigate extinction and reinstatement of methamphetamine (MA)‐induced CPP in zebrafish and evaluate the model's predictive validity. Zebrafish received different doses of MA (0–60 mg/kg) during CPP training. The preferred dose of MA at 40 mg/kg was used for extinction via either confined or nonconfined procedures. The extinguished CPP was reinstated by administering a priming dose of MA (20 mg/kg) or various stressors. To assess persistent susceptibility to reinstatement, MA CPP and reinstatement were retested following 14 days of abstinence. In addition, the effects of SCH23390, naltrexone, and clonidine on MA CPP during acquisition, expression, or reinstatement phases were monitored. MA induced CPP in a dose‐dependent manner. Both nonconfined and confined extinction procedures time‐dependently reduced the time spent on the MA‐paired side. A priming dose of MA, chasing stress, or yohimbine reinstated the extinguished CPP. After 14 days of abstinence, the MA CPP remained extinguished and was significantly reinstated by MA priming or chasing stress. Similar to the observations in rodents, SCH23390 suppressed the acquisition of MA CPP, naltrexone reduced the expression and MA priming‐induced reinstatement, while clonidine prevented stress‐induced reinstatement of MA CPP. This work expanded the zebrafish CPP paradigm to include extinction and reinstatement phases, demonstrating predictive validity and highlighting its potential as a valuable tool for exploring drug relapse.Keywords:
Conditioned place preference
Extinction (optical mineralogy)
Methamphetamine
The rewarding effects of drugs of abuse are often studied by means of the conditioned place preference (CPP) paradigm. CPP is one of the most widely used models in behavioral pharmacology, yet its theoretical underpinnings are not well understood, and there are very few studies on the methodological and theoretical aspects of this model. An important drawback of the classical CPP paradigm is that it often does not show dose-dependent results. The persistence of the conditioned response, i.e. the time required until the CPP effect is extinct, may be related to the strength of conditioning, which in turn may be related to the rewarding efficacy of a drug. Resistance to extinction may therefore be a useful additional measure to quantify the rewarding effect of drugs. In the present study we examined the persistence of drug-environment associations after conditioning with morphine (1, 3 and 10 mg/kg i.p.), oxycodone (0.3, 1 and 3 mg/kg i.p.) and heroin (0.05, 0.25 and 0.5 mg/kg i.p.) by repeated retesting in the CPP apparatus (15-min sessions, 5 days/week) until the rats reached extinction (i.e. less than 55% preference over 3 consecutive sessions). Following an unbiased CPP protocol, morphine, oxycodone and heroin induced CPP with minimal effective doses of 3, 1 and 0.25 mg/kg, respectively, and with similar effect sizes for each CPP-inducing dose. The number of sessions required for extinction was positively correlated with the dose of the drug (experiment 1: 18 and 45 sessions for 3 and 10 mg/kg morphine, and 19 and 27 sessions for 1 and 3 mg/kg oxycodone; experiment 2: 12 and 24 sessions for 3 and 10 mg/kg morphine, and 10 and 14 sessions for 0.25 and 0.5 mg/kg heroin). These findings suggest that the use of an extinction paradigm can extend the quantitative assessment of the rewarding effect of drugs – however, within certain limits only. The present paradigm appears to be less suited for comparing the rewarding efficacy of different drugs due to great test-retest variability. Finally, the additional potential gain of information using this paradigm has to be weighed against the considerably large amount of additional time and effort.
Conditioned place preference
Extinction (optical mineralogy)
Cite
Citations (42)
Vertebrates use adaptive mechanisms when exposed to physiologic stresses. However, the mechanisms of pigmentation regulation in response to physiologic stresses largely remain unclear. To address this issue, we developed a novel pigmentation model in adult zebrafish using coldwater exposure (cold zebrafish). When zebrafish were maintained at 17 °C, the pigmentation of their pigment stripes was reduced compared with zebrafish at 26.5 °C (normal zebrafish). In cold zebrafish, gene expression levels of tyrosinase and dopachrome tautomerase, which encode enzymes involved in melanogenesis, were down-regulated, suggesting that either down-regulation of melanin synthesis occurred or the number of melanophores decreased. Both regular and electron microscopic observation of zebrafish skin showed that the number of melanophores decreased, whereas aggregation of melanosomes was not changed in cold zebrafish compared with normal zebrafish. Taken together, we here show that cold exposure down-regulated adult zebrafish pigmentation through decreasing the number of melanophores and propose that the cold zebrafish model is a powerful tool for pigmentation research.
Melanosome
Melanophore
Morpholino
Cite
Citations (14)
Methamphetamine
Conditioned place preference
Cite
Citations (4)
Methamphetamine
Conditioned place preference
Locomotor activity
Adult male
Behavioral sensitization
Differential effects
Cite
Citations (135)
The effects of 5-HT3 receptor antagonists, MDL72222 and ICS205-930, on cocaine- and methamphetamine-induced place preference were examined. Cocaine (0.5-4.0 mg/kg, ip) and methamphetamine (0.25-2.0 mg/kg, ip) induced a dose-dependent place preference. The cocaine (4 mg/kg)-induced place preference was blocked by both MDL72222 and ICS205-930 (0.1 mg/kg, ip). On the other hand, the dose (0.1 mg/kg) of 5-HT3 antagonists did not block the methamphetamine (2 mg/kg)-induced place preference, although a higher dose (1.0 mg/kg) of 5-HT3 receptor antagonists did block it. The difference in sensitivity may reflect a difference in attack point in dopaminergic system of these two psychostimulants. Our findings suggest that the rewarding effects of cocaine and methamphetamine may be indirectly regulated by 5-HT3 receptor; cocaine being more sensitive to 5-HT3 receptor antagonists than methamphetamine.
Methamphetamine
Conditioned place preference
5-HT3 receptor
Cite
Citations (22)
Aim To establish the morphine-induced conditioned place preference( CPP) model and explore the optimum conditionof the CPP formation in zebrafish. Methods According to the principle of CPP and the biological characteristics of the zebrafish,after determination of the natural preference of the zebrafish,the zebrafish was given morphine of different concentrations by intraperitoneal injection,and then it was matched with non-preference compartment; subsequently,the zebrafish was given equal volume of saline and then matched with preference compartment. Morphine-induced CPP effect on zebrafish after three consecutive trainings were observed. Results After beinggiven 40 ～ 50 μg·g- 1morphine by intraperitoneal injection and three consecutive trainings,we found that the activity time of zebrafish in non-preference compartment was increased significantly. Compared with pre-training or saline group,there was a significant difference. Conclusion The zebrafish shows significant place preference by intraperitoneal injection of 40 ～ 50 μg·g- 1 morphine and three consecutive trainings.
Conditioned place preference
Intraperitoneal injection
Animal model
Cite
Citations (0)
Οι καρδιαγγειακές παθήσεις αποτελούν στην εποχή μας μία από τις πρώτες αιτίες θανάτου στον ανεπτυγμένο κόσμο. Επίσης, πολύ σημαντική είναι η συμβολή της αγγειογένεσης στην ανάπτυξη των καρκινικών όγκων. Καθίσταται λοιπόν αναγκαία η συμβολή της βασικής έρευνας ώστε να μελετηθούν καλύτερα οι μηχανισμοί των παθήσεων αυτών αλλά και να ανακαλυφθούν νέα φάρμακα που σχετίζονται με την αγγειογένεση. Τα τελευταία χρόνια σημαντικό ρόλο παίζει προς αυτές τις κατευθύνσεις το ζωϊκό πρότυπο μοντέλο zebrafish. Το zebrafish (Danio rerio) χρησιμοποιείται ευρέως ως ζωικό μοντέλο για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας των καρδιαγγειακών παθήσεων. Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται ο καρδιακός φαινότυπος υποτροφικού κόλπου, myh6-/-, σε ενήλικα ψάρια, τα οποία φέρουν μετάλλαξη στη βαριά αλυσίδα κολπικής μυοσίνης του zebrafish. Οι ομόζυγοι φορείς επιβιώνουν μέχρι την ενηλικίωση και είναι γόνιμοι. Στα ενήλικα μεταλλαγμένα ψάρια, ο κόλπος παραμένει υποπλαστικός και εμφανίζει εναπόθεση ελαστίνης, ενώ οι κοιλίες παρουσιάζουν αυξημένο μέγεθος. Στα θηλαστικά, η υπερτροφία είναι ο συνηθέστερος μηχανισμός που οδηγεί σε καρδιομεγαλία. Χρησιμοποιώντας την ανοσοϊστοχημεία και συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης για να μετρήσουμε το μέγεθος, την πυκνότητα και τον πολλαπλασιασμό των καρδιομυοκυττάρων, αποδεικνύεται ότι η μεγέθυνση της κοιλίας myh6-/- οφείλεται κατά κύριο λόγο στην υπερπλασία. Εντούτοις, εντοπίσαμε παρόμοια μεταγραφικά προφίλ στην απόκριση υπερτροφίας θηλαστικών μέσω RT-PCR των υπερπλαστικών κοιλιών. Περαιτέρω, δείχνουμε την ενεργοποίηση της οδού του στρες-ΕΔ με ανάλυση ανοσοαποτυπώματος κατά Western. Συμπερασματικά, μπορούμε να υποθέσουμε, με βάση το μοντέλο μας, ότι μονοπάτια μοριακής σηματοδότησης που συνδέονται με την υπερτροφία στα θηλαστικά, σε συνδυασμό με την ενεργοποίηση του στρες-ΕΔ, καταλήγουν σε υπερπλασία στο zebrafish. Επιπλέον, αυτή είναι η πρώτη φορά που αναφέρθηκε η εναπόθεση ελαστίνης στον κόλπο. Παράλληλα, μελετήθηκαν μικρά μόρια που αναστέλλουν την αγγειογένεση και είναι ελπιδοφόρα υποψήφια φάρμακα για τον καρκίνο, τις αμφιβληστροειδοπάθειες και τον εκφυλισμό της ωχράς κηλίδας που σχετίζεται με την ηλικία. Η in vivo φαινοτυπική διαλογή σε zebrafish (Danio rerio) αναδεικνύεται ως μια ισχυρή μεθοδολογία για την ταυτοποίηση και βελτιστοποίηση νέων ενώσεων με φαρμακολογική δράση. Το zebrafish παρέχει αρκετά πλεονεκτήματα για τις in vivo φαινοτυπικές παρατηρήσεις ειδικά για την αγγειογένεση, καθώς αναπτύσσεται ταχέως και δεν βασίζεται σε λειτουργικό καρδιαγγειακό σύστημα για να επιβιώσει για αρκετές ημέρες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιούμε μια διαγονιδιακή σειρά που επιτρέπει τη μη επεμβατική παρακολούθηση της αγγειογένεσης σε κυτταρικό επίπεδο. Η αναστολή της αγγειογένεσης μπορεί να παρατηρηθεί κάτω από ένα στερεοσκόπιο φθορισμού και να ποσοτικοποιηθεί. Εκμεταλλευόμενοι τις δυνάτοτητες του zebrafish, χρησιμοποιήσαμε μια σειρά από 60 καινοτόμες ενώσεις που σχεδιάστηκαν με βάση την αναστολή του υποδοχέα VEGFR2. Στα πειράματα αυτά μπορεί να να υπολογιστεί η συγκέντρωση στην οποία προκαλείται τοξικότητα και να καταδειχθούν πιθανές παρενέργειες των υπό εξέταση ουσιών. Με αυτόν τον τρόπο αποκαλύφθηκαν 6 αντιστρεπτοί αναστολείς της αγγειογένεσης. Τέλος, στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής επιχειρήθηκε να ανιχνευθούν γονίδια τα οποία παίζουν ρόλο στη μορφογένεση των καρδιακών βαλβίδων και να αποδειχθεί η σχέση τους μέσω στοχευμένης μεταλλαξιγένεσης με τη βοήθεια του συστήματος CRISPR-Cas και να δημιουργηθεί μια διαγονιδιακή σειρά zebrafish που να αποκρίνεται στις αλλαγές της διατμητικής τάσης. Συμπερασματικά, από την παρούσα διατριβή προκύπτει η μεγάλη δυνατότητα του zebrafish για ανασύσταση/αναδιαμόρφωση της καρδιάς του σε παθολογικές καταστάσεις και αποδεικνύεται η ικανότητά του να χρησιμοποιείται ως ιδανικό μοντέλο για τη μελέτη των καρδιαγγειακών παθήσεων.
Danio
Cite
Citations (0)
Methamphetamine
Conditioned place preference
Cite
Citations (10)
Στα ζωικά είδη με έντονες κοινωνικές αλληλεπιδράσεις και ιεραρχίες, παρατηρούνται δύο κύριες στρατηγικές αντιμετώπισης καταστάσεων ή αλλιώς ηθολογικά πρότυπα: η προδραστική και η αναδραστική. Τα χαρακτηριζόμενα ως προδραστικά άτομα θεωρείται πως ακολουθούν κυρίως μία κυριαρχική, επιθετική, τολμηρή και στερεοτυπική συμπεριφορά, ενώ τα αναδραστικά, μία υποτακτική, επιφυλακτική, φοβική και ευέλικτη συμπεριφορά. Οι συγκεκριμένες στρατηγικές είναι πολύ σημαντικές για την επιβίωση, την ομοιόσταση, την κοινωνική μάθηση, τη διερεύνηση, την αξιοποίηση διαθέσιμων πόρων καθώς και την αναπαραγωγή. Η συσχέτιση της επιθετικής συμπεριφοράς με άλλες εκφάνσεις της προσωπικότητας έχει διερευνηθεί σε πτηνά, τρωκτικά και θηλαστικά, όπου η επιθετική συμπεριφορά φάνηκε να συνδέεται με την εξερευνητική συμπεριφορά και την τολμηρότητα. Η απόκριση των οργανισμών σε δυσμενή ερεθίσματα και προκλήσεις του φυσικού και κοινωνικού περιβάλλοντος διέπεται από περίπλοκους μοριακούς και νευροενδοκρινικούς μηχανισμούς. Η απόκριση των τελεόστεων στην καταπόνηση ρυθμίζεται μέσω της ενεργοποίησης του άξονα Υποθαλάμου – Υπόφυσης – Μεσονέφρου (Hypothalamic – pituitary – interrenal axis, HPI), οδηγώντας τελικά στην έκκριση της κορτιζόλης. Η επίδραση της κορτιζόλης κατά την απόκριση στο στρες ρυθμίζεται μέσω δύο υποδοχέων, του γλυκοκορτικοστεροειδούς (GR) και του αλατοκορτικοστεροειδούς (MR), με γενωμική και μη γενωμική δράση στη φυσιολογία και συμπεριφορά. Το zebrafish αν και στη φύση αποτελεί ένα κοινωνικό είδος, με ισχυρή τάση σχηματισμού κοπαδιού, σε πληθυσμούς χαμηλής συγκέντρωσης, εμφανίζει επιθετικές αλληλεπιδράσεις οι οποίες στην πλειοψηφία τους καταλήγουν σε σχέσεις κυριαρχίας – υποτέλειας και στα δύο φύλα. Επιπλέον, έκθεση σε οξύ και χρόνιο στρες πυροδοτεί στο zebrafish συγκεκριμένα ηθολογικά πρότυπα και μετρήσιμες συμπεριφορές που το καθιστούν πολύτιμο οργανισμό μοντέλο για τη μελέτη μηχανισμών που ρυθμίζουν το στρες. Σκοπός της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της αγωνιστικής συμπεριφοράς και των ηθολογικών προτύπων στο zebrafish, καθώς και ο ρόλος των γλυκοκορτικοστεροειδών υποδοχέων στην απόκριση στην καταπόνηση τόσο σε ενήλικα zebrafish όσο και σε προνύμφες. Αρχικά (Κεφάλαιο 2), ενήλικα αρσενικά zebrafish τα οποία εκτέθηκαν σε δοκιμασία δυαδικής αγωνιστικής συμπεριφοράς και χαρακτηρίστηκαν ως κυρίαρχα και υποτελή, εκτέθηκαν στη συνέχεια σε μία σειρά συμπεριφορικών δοκιμασιών προκειμένου να διερευνηθεί η υπόθεση σχετικά με τη συνέπεια της απόκρισης στα διαφορετικά ηθολογικά πρότυπα του zebrafish. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως τα υποτελή άτομα εμφάνισαν μεγαλύτερη άνεση εξερεύνησης της κάθετης στήλης του νερού σε άγνωστο περιβάλλον σε σύγκριση με τα κυρίαρχα. Παράλληλα, τα άτομα που εμφάνισαν αυξημένη εξερευνητική τάση σε κατάλληλα σχεδιασμένη συμπεριφορική δοκιμασία έδειξαν και έναν πιο αγχώδη φαινότυπο σε σχέση με τα μη εξερευνητικά. Με δεδομένο πως οι συμπεριφορικές αποκρίσεις των ατόμων δεν ακολούθησαν τα πρότυπα που έχουν οριστεί στη βιβλιογραφία, δεν ήταν εφικτός ο εντοπισμός κάποιας συνέπειας στην απόκριση των δύο ηθολογικών προτύπων. Συμπερασματικά, οι νικητές ή οι χαμένοι μίας δυαδικής αγωνιστικής αλληλεπίδρασης δεν αντικατοπτρίζουν ένα προδραστικό ή αναδραστικό ηθολογικό πρότυπο αντίστοιχα, καθώς η έκβαση μίας δυαδικής αγωνιστικής αλληλεπίδρασης και η θέση που θα καταλάβει κάθε άτομο στην κοινωνική αυτή ιεραρχία εξαρτώνται και από άλλους παράγοντες πέρα από το ηθολογικό πρότυπο του ατόμου. Στη συνέχεια (Κεφάλαιο 3), διερευνήθηκαν οι διαφορές σε μοριακούς και ενδοκρινικούς ρυθμιστές στα διαφορετικά ηθολογικά πρότυπα καθώς και η σχέση της αγωνιστικής συμπεριφοράς με το σεροτονεργικό σύστημα. Ενήλικα αρσενικά zebrafish εκτέθηκαν σε δοκιμασία δυαδικής αγωνιστικής συμπεριφοράς και στα κυρίαρχα και υποτελή άτομα που προέκυψαν ακολούθησε μία σύντομη χορήγηση φλουοξετίνης. Ύστερα από τον φαρμακολογικό χειρισμό παρατηρήθηκε εκ νέου η αγωνιστική τους συμπεριφορά καθώς και η δομή της κοινωνικής τους ιεραρχίας και τελικά τα άτομα θανατώθηκαν προκειμένου να εκτιμηθούν τόσο η συγκέντρωση της κορτιζόλης όσο και η έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Η οξεία χορήγηση φλουοξετίνης επηρέασε σημαντικά τη συμπεριφορά των zebrafish και τα επίπεδα έκφρασης διαφόρων γονιδίων, καθώς μείωσε σημαντικά την επιθετική συμπεριφορά των κυρίαρχων ατόμων και εξάλειψε την ακινητοποιημένη και αμυντική συμπεριφορά των υποτελών ατόμων. Αν και δεν εντοπίστηκε κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά στη συγκέντρωση της κορτιζόλης μεταξύ των κυρίαρχων και υποτελών ατόμων, τα άτομα στα οποία χορηγήθηκε φλουοξετίνη εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη συγκέντρωση κορτιζόλης σε σύγκριση με τα άτομα χωρίς κάποιο φαρμακολογικό χειρισμό. Τέλος, η φλουοξετίνη άσκησε ισχυρή επίδραση και σε μοριακούς ρυθμιστές της νευρωνικής λειτουργίας, του στρες και των ηθολογικών προτύπων. Η επίδραση της φλουοξετίνης στον άξονα ΗΡΙ διερευνήθηκε περαιτέρω στο Κεφάλαιο 4, όπου χορηγήθηκαν τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις της ουσίας σε προνύμφες zebrafish, οι οποίες στη συνέχεια εκτέθηκαν σε μία δοκιμασία εναλλαγής φωτός – σκότους προκειμένου να εκτιμηθεί η συμπεριφορική τους απόκριση στην καταπόνηση. Η σύντομη χορήγηση υψηλής συγκέντρωσης φλουοξετίνης είχε ως αποτέλεσμα τη στατιστικά σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης της κορτιζόλης στις προνύμφες καθώς και τη μείωση της κινητικότητας τους ως απόκριση στις εναλλαγές φωτεινότητας. Στόχος των επόμενων πειραμάτων αποτέλεσε η διερεύνηση του ρόλου των GR και MR στους νευροενδοκρινικούς μηχανισμούς που ρυθμίζουν την απόκριση των οργανισμών σε συνθήκες καταπόνησης, αλλά και σε κοινωνικές προκλήσεις του περιβάλλοντος. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν γενετικές γραμμές zebrafish με σίγαση στους GR και MR, προκειμένου να χαρακτηριστούν ηθολογικά ενήλικα άτομα των συγκεκριμένων στελεχών και να εντοπιστούν τυχόν διαφορές στην απόκρισή τους τόσο σε συνθήκες οξείας καταπόνησης όσο και χρόνιας (Κεφάλαιο 5). Από τα αποτελέσματα των συγκεκριμένων πειραμάτων φάνηκε μία συμπληρωματική δράση των δύο υποδοχέων στη συμπεριφορική απόκριση των ενηλίκων zebrafish στο στρες. Τα mr -/- άτομα εμφάνισαν έναν πιο αγχώδη φαινότυπο σε σύγκριση με τα gr-/-, ενώ δεν εντοπίστηκε κάποια διαφορά ως προς την κοινωνική προτίμηση των δύο στελεχών σε σύγκριση με τα άτομα αγρίου τύπου. Τα gr -/- εμφάνισαν υπερκορτιζολαιμία σε συνθήκες ηρεμίας, υποδεικνύοντας τη συμμετοχή του GR στο σύστημα αρνητικής ανάδρασης της κορτιζόλης. Η υψηλή ενεργότητα του HPI άξονα που εμφάνισαν τα gr -/- άτομα συνοδεύτηκε και από έναν έντονα αναδραστικό φαινότυπο σε δοκιμασίες που επιτρέπουν την έκφραση της αγωνιστικής συμπεριφοράς του είδους. Τέλος (Κεφάλαιο 6), μελετήθηκε και η συμπεριφορική και ενδοκρινική απόκριση σε οξεία καταπόνηση σε προνύμφες zebrafish αγρίου τύπου, gr -/-, mr -/- και gr -/-mr -/-. Η υπεροκορτιζολαιμία που παρατηρήθηκε στα ενήλικα gr -/-, εντοπίστηκε και στις προνύμφες τόσο σε κατάσταση ηρεμίας όσο και σε συνθήκες οξείας καταπόνησης. Οι συμπεριφορικές δοκιμασίες στις οποίες εκτέθηκαν οι προνύμφες ήταν μία δοκιμασία απόκρισης σε μηχανική καταπόνηση και δύο δοκιμασίες εναλλαγής φωτός – σκότους με δύο διαφορετικές εντάσεις φωτεινότητας. Οι τρεις γενετικές γραμμές με μετάλλαξη στους υποδοχείς των γλυκοκορτικοστεροειδών εμφάνισαν μία διαταραγμένη ένταση απόκρισης στα μηχανικά ερεθίσματα αλλά και στο επίπεδο εξοικείωσής τους. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει μία πιθανή αλληλεπίδραση των υποδοχέων των γλυκοκορτικοστεροειδών με την ενεργότητα των νευρώνων Mauthner, οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για τη συμπεριφορική απόκριση των προνυμφών σε αυτού του είδους τα ερεθίσματα. Επιπλέον φάνηκε πως η ένταση του φωτισμού στον οποίο εκτίθενται οι προνύμφες σε δοκιμασίες εναλλαγής φωτός – σκότους διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο τόσο στην ένταση όσο και στο μοτίβο της συμπεριφορικής απόκρισης. Οι διαφορές στην απόκριση των προνυμφών με σίγαση στα γονίδια των γλυκοκορτικοστεροειδών υποδοχέων στις διαφορετικές εντάσεις φωτεινότητας ενδεχομένως οφείλονται σε προβλήματα στην οπτική επεξεργασία και στην προσαρμογή στην εναλλαγή των φωτεινών ερεθισμάτων.
Cite
Citations (0)
Εισαγωγή: Τα βαρέα μέταλλα καθίστανται εξαιρετικά τοξικά όταν βρίσκονται σε υψηλές συγκεντρώσεις και αποκτούν συνήθως πρόσβαση στο οικοσύστημα μέσω πολλών διαφορετικών πηγών όπως απόβλητα από βιομηχανίες, απορροή γεωργικών προϊόντων, ακατέργαστα λύματα και η απομάκρυνσή τους από το περιβάλλον είναι ιδιαίτερα δύσκολη. Η μόλυνση του νερού από βαρέα μέταλλα μπορεί να έχει δυσμενείς επιπτώσεις στην οικολογική ισορροπία, συμπεριλαμβανομένης της απώλειας της υδάτινης ποικιλομορφίας, και δεν θεωρείται ασφαλής όχι μόνο για τους υδρόβιους οργανισμούς αλλά και για τους ανθρώπους. Σκοπός: Η παρούσα διατριβή εξετάζει την τοξικότητα των βαρέων μετάλλων σε ενήλικα άτομα zebrafish, καθώς και στην ανάπτυξη των εμβρύων έως και στις 96 ώρες μετά τη γονιμοποίηση. Πιο συγκεκριμένα: α) Ο σκοπός της 1ης ερευνητικής ενότητας ήταν η εκτίμηση του παθολογικού αποτυπώματος που προκαλούν τα βαρέα μέταλλα (Χαλκός, Ψευδάργυρος, Σίδηρος, Κοβάλτιο, Χρώμιο, Αλουμίνιο, Μαγγάνιο και Μολυβδαίνιο) μετά από μακρά χορήγησή τους σε ενήλικα ψάρια zebrafish μέσω της τροφής, και β) Ο σκοπός της 2ης ερευνητικής ενότητας ήταν η διερεύνηση των τοξικοπαθολογικών μεταβολών στα έμβρυα zebrafish από βαρέα μέταλλα μέσω του νερού διαβίωσης. Μέθοδος: Η πειραματική μελέτη πραγματοποιήθηκε από τον Απρίλιο 2016 έως και τον Ιανουάριο 2019, στο Εργαστήριο Υδατοκαλλιεργειών του Τμήματος Γεωπονίας του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων υπό την εποπτεία του Τμήματος Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. α) Στην πρώτη μελέτη, δείγματα 40 ενήλικων zebrafish εκτέθηκαν σε κάθε ένα από τα 8 μέταλλα. Η συγκέντρωση χορήγησης για κάθε βαρύ μέταλλο αυξανόταν σταδιακά, τον πρώτο μήνα σε 1mg/kg/ημέρα, το δεύτερο μήνα σε 5mg/kg/ημέρα και τον τρίτο μήνα παρέμενε ίδια, 5mg/kg/ημέρα. Η εφαρμογή του κάθε βαρέος μετάλλου ανά ομάδα zebrafish πραγματοποιήθηκε για 3 μήνες όσο περίπου απαιτείται για την ωρίμανση των γονάδων στο συγκεκριμένο είδος. Οι δειγματοληψίες πραγματοποιήθηκαν σε τρεις χρονικές περιόδους, μία δειγματοληψία για κάθε μήνα. Καθ’ όλη τη διάρκεια της χορήγησης των βαρέων μετάλλων γινόταν καταγραφή των φυσικοχημικών παραμέτρων, της θνησιμότητας, και γενικά οποιασδήποτε μη φυσιολογικής συμπεριφοράς των ψαριών και του περιβάλλοντος. Για κάθε βαρύ μέταλλο ελέγχθηκαν ξεχωριστά η βιοσυσσώρευση, οι ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις, οι βασικές αιματολογικές παράμετροι, έτσι ώστε τελικώς να καθοριστεί το τοξικοπαθολογικό προφίλ του zebrafish. β) Στη δεύτερη μελέτη επιλέχθηκαν - με τυχαία δειγματοληψία - 120 γονιμοποιημένα ωάρια (2-4 κυττάρων) zebrafish και με τυχαία δειγματοληψία χωρίστηκαν σε 3 πειραματικές ομάδες (εις διπλούν) για κάθε μέταλλο και 1 ομάδα ελέγχου (εις διπλούν). Η κάθε πειραματική ομάδα καθώς και η ομάδα ελέγχου απαρτιζόταν από 15 γονιμοποιημένα ωάρια zebrafish και τοποθετούνταν σε ξεχωριστή θέση της πλάκας Corning®. Συγκεκριμένα, τα βαρέα μέταλλα εφαρμόστηκαν χωριστά σε μικρές ομάδες ωαρίων (n = 15), μετά από τυχαία επιλογή. Η εφαρμογή των βαρέων μετάλλων έγινε με 3 συγκεντρώσεις ξεκινώντας από 500 mg/l και τελειώνοντας με 5 * 10-2 mg/l (500 → 50 → 0,05 mg/l). Η κάθε πειραματική ομάδα καθώς και η ομάδα ελέγχου έγιναν επί δύο, δηλαδή σύνολο για την κάθε ομάδα 30 ωάρια. Υπήρχαν δηλαδή, 6 θέσεις της πλάκας Corning® για το κάθε μέταλλο με τις τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις (2 θέσεις για την κάθε συγκέντρωση) και 2 θέσεις της πλάκας Corning® με τις ομάδες ελέγχου, οι οποίες ήταν ίδιες και για τα 8 μέταλλα. Οι παρατηρήσεις που γινόντουσαν, αφορούσαν στην εκκόλαψη των γονιμοποιημένων ωαρίων, στην επιβίωση των προνυμφών, στις σκελετικές δυσμορφίες αυτών και σε άλλες λειτουργικές διαταραχές που μπορεί να προέκυπταν. Στις 3 πρώτες εκκολαπτόμενες προνύμφες από κάθε πειραματική ομάδα που δεν παρουσίαζαν ευθύς εξαρχής σκελετικά προβλήματα γινόταν η μέτρηση του καρδιακού ρυθμού. Οι παρατηρήσεις και οι ηχογραφήσεις γινόταν στις πρώτες 48 ώρες κάθε 6 ώρες και για τις επόμενες 48 κάθε 12 ώρες με τη βοήθεια ενός ηλεκτρονικού μικροσκοπίου και ενός στερεοσκοπίου με ενσωματωμένη κάμερα. Για τις ανάγκες μέτρησης του καρδιακού ρυθμού επιλέχθηκαν τυχαία τρεις προνύμφες για κάθε πειραματική ομάδα στις οποίες έγιναν επαναλαμβανόμενες μετρήσεις. Η μέτρηση του καρδιακού ρυθμού γινόταν 6 ώρες μετά την εκκόλαψη για κάθε πειραματική ομάδα. Στατιστικά εφαρμόστηκαν ανάλυση παλινδρόμησης Cox για να εξεταστούν οι διαφορές στο χρόνο εκκόλαψης και στους χρόνους επιβίωσης μεταξύ των διαφορετικών ομάδων συγκέντρωσης του κάθε μετάλλου, η μη παραμετρική δοκιμασία log - rank για τη σύγκριση των κατανομών του χρόνου εκκόλαψης μεταξύ των 8 βαρέων μετάλλων όπως και μεταξύ των επιπέδων συγκέντρωσης του μετάλλου. Για τη συγκριτική μελέτη όλων των μετάλλων ως προς την επίδρασή τους στο zebrafish πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες log-rank χρησιμοποιώντας το SPSS v. 21, ενώ για την υπόθεση αναλογικών κινδύνων, ο υπολογισμός της ισχύος του Cox και το κοινό μοντέλο Frailty εφαρμόστηκαν με τη στατιστική γλώσσα R εξοπλισμένη με τα πακέτα συναρτήσεων «frailtypack» και «powerSurvEpi». Τέλος, εφαρμόστηκε το πακέτο «rpart» της γλώσσας R για την υλοποίηση του δέντρου ταξινόμησης. Αποτελέσματα: 1) Από τα ευρήματα της πρώτης μελέτης παρατηρήθηκε ότι ο χαλκός, το αλουμίνιο και το χρώμιο αποτελούν μια ομάδα υψηλότερης τοξικότητας στα βράγχια μεταξύ των 8 μετάλλων, ενώ ο σίδηρος και το χρώμιο, ως δύο βαρέα μέταλλα που έχουν στατιστικά υψηλότερη τοξική επίδραση στο ήπαρ και τους νεφρούς συγκρινόμενα με την ομάδα ελέγχου. Επίσης διαπιστώθηκαν: α) παθολογικά συμπτώματα στα βράγχια των zebrafish (οίδημα στο χείλος των δευτερογενών νηματίων και υπερπλασία του επιθηλίου, καταστροφή στηρικτικών κυττάρων σε πρόδρομες τηλεαγγιεκτατικές διεργασίες στα δευτερογενή νημάτια, βοστρυχόμορφα δευτερογενή νημάτια και τηλεαγγειεκτασία στο σύνολο του μήκους των νηματίων, παρουσία ατρακτόμορφων ερυθρών αιμοσφαιρίων μεταξύ των δευτερογενών νηματίων, αποκόλληση του επιθηλίου των δευτερογενών νηματίων στην οιδηματική περιοχή με ύπαρξη άφθονου εοσινόφιλου υλικού εντός). β) παθολογικά συμπτώματα στους μύες των zebrafish (πρώιμη διήθηση μακροφάγων σε εκφυλισμένες μυϊκές ίνες που εμφανίζουν οξεία κατάτμηση και κενοτοπίωση, οξεία νεκρωτική μυΐτιδα συσχετιζόμενη με τοξίκωση, διογκωμένες υπερ-εωσινόφιλες μυϊκές ίνες (Hya) με απώλεια της τυπικής δοκιδώδους γράμμωσης, οξεία τμηματική νέκρωση μυϊκών ινών, ολοκληρωτική ρήξη μυϊκής ίνας). γ) παθολογικά συμπτώματα στο έντερο των zebrafish (ήπια ατροφία εντερικών λαχνών, ήπια έως μέτρια μείωση του ύψους των λαχνών, διαβρώσεις και έλκη στα περιφερικά άκρα των λαχνών, σοβαρή ελκωτική εντεροπάθεια, υποβλεννογόνια αιμορραγία του εντέρου, κυτταρική διήθηση εντέρου, εστιακή υπερπλασία εντέρου και τα υπερπλαστικά κύτταρα μικρότερα και περισσότερο βασίφιλα σε σύγκριση με το φυσιολογικό βλεννογόνο). 2) Από τα ευρήματα της δεύτερης μελέτης παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στο ποσοστό εκκόλαψης και επιβίωσης των προνυμφών μεταξύ της ομάδας ελέγχου και στις περισσότερες από τις πειραματικές ομάδες βαρέων μετάλλων σε διάφορες συγκεντρώσεις. Η υψηλότερη συγκέντρωση (500 mg/l) των συγκρινόμενων βαρέων μετάλλων είχε ως αποτέλεσμα τη συνολική θνησιμότητα ωαρίων/προνυμφών εντός 96 ωρών και σημαντικά χαμηλότερο προσδόκιμο ζωής. Η πιο σημαντική επίδραση στο χρόνο εκκόλαψης μεταξύ των δοκιμασμένων μετάλλων παρατηρήθηκε στον ψευδάργυρο και στο μολυβδαίνιο, σε αντίθεση με το σίδηρο που δεν διέφερε στατιστικά από την ομάδα ελέγχου. Ο χαλκός, το κοβάλτιο, το χρώμιο, το αλουμίνιο και το μαγγάνιο επηρέασαν τα ωάρια με στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάλογες των συγκεντρώσεων των μετάλλων. Επίσης, από τα ευρήματα της μελέτης παρατηρήθηκε σημαντική σχέση μεταξύ του καρδιακού ρυθμού των προνυμφών και της συγκέντρωσης των μετάλλων, και συγκεκριμένα, οι υψηλότερες συγκεντρώσεις των μετάλλων αντιστοιχούσαν σε υψηλότερο καρδιακό ρυθμό. Ακόμη, παρατηρήθηκε ότι ο ψευδάργυρος, το μολυβδαίνιο και ο χαλκός ως τα πιο τοξικά βαρέα μέταλλα προκαλώντας αυξημένο ποσοστό κινδύνου θνησιμότητας έως στις 96 ώρες και μικρότερο προσδόκιμο ζωής. Τέλος, οι σκελετικές παραμορφώσεις που παρατηρήθηκαν περιστασιακά δεν επηρέασαν σημαντικά το συνολικό προσδόκιμο ζωής των εκκολαφθέντων ωαρίων. Συμπεράσματα: Με βάση τα παρόντα ευρήματα διαπιστώνεται ότι η παρατεταμένη έκθεση του zebrafish σε συγκεντρώσεις βαρέων μετάλλων μπορεί να προκαλέσει παθολογικές αλλοιώσεις σε διάφορα όργανα. Επίσης, τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν την επίδραση των 8 βαρέων μετάλλων (Χαλκός, Ψευδάργυρος, Σίδηρος, Κοβάλτιο, Χρώμιο, Αλουμίνιο, Μαγγάνιο, Μολυβδαίνιο) στον ρυθμό επώασης των ωαρίων του zebrafish, στην επιβίωση των προνυμφών καθώς και στον καρδιακό ρυθμό. Έτσι, τονίζεται η σημασία της ποσοτικοποίησης και της απομάκρυνσης των βαρέων μετάλλων από τα διάφορα υδατικά συστήματα, με στόχο τον μετριασμό των επιπτώσεων στην υδρόβια ζωή και κατ’ επέκταση στην ανθρώπινη υγεία. Αυτές οι διαπιστώσεις παρουσιάζουν τις τοξικές επιδράσεις των βαρέων μετάλλων στην εμβρυϊκή ανάπτυξη του zebrafish και υποδηλώνουν την ανάγκη για περαιτέρω πειράματα για την αποσαφήνιση των διαφορετικών μηχανισμών στις οποίες βασίζονται τέτοιες αλλοιώσεις και οδηγούν στην ανάγκη της πρόληψης της εισόδου των βαρέων μετάλλων στο υδάτινο περιβάλλον.
Cite
Citations (0)