Rational Design of a Humanized Glucagon‐Like Peptide‐1 Receptor Agonist Antibody
Yong ZhangHuafei ZouYing WangDawna CaballeroJ. GonzálezElizabeth ChaoGus WelzelWeijun ShenDanling WangPeter G. SchultzFeng Wang
4
Citation
34
Reference
10
Related Paper
Citation Trend
Abstract:
Abstract Bovine antibody BLV1H12 possesses a unique “stalk–knob” architecture in its ultralong heavy chain CDR3, allowing substitutions of the “knob” domain with protein agonists to generate functional antibody chimeras. We have generated a humanized glucagon‐like peptide‐1 (GLP‐1) receptor agonist antibody by first introducing a coiled‐coil “stalk” into CDR3H of the antibody herceptin. Exendin‐4 (Ex‐4), a GLP‐1 receptor agonist, was then fused to the engineered stalk with flexible linkers, and a Factor Xa cleavage site was inserted immediately in front of Ex‐4 to allow release of the N‐terminus of the fused peptide. The resulting clipped herceptin–Ex‐4 fusion protein is more potent in vitro in activating GLP‐1 receptors than the Ex‐4 peptide. The clipped herceptin–Ex‐4 has an extended plasma half‐life of approximately four days and sustained control of blood glucose levels for more than a week in mice. This work provides a novel approach to the development of human or humanized agonist antibodies as therapeutics.Keywords:
Ex vivo
To investigate the methods and solve the technical bottlenecks in the preparation of recombinant human protein hZP3 using the baculovirus expression system and pave the technical ground for the production and application of recombinant hZP3.The recombinant vector pFASTBAC HTa-hZP3 was constructed and transferred to competent E. coli cells carrying bacmid to produce recombinant bacmid by homologous recombination. Sf9 cells were transfected with the recombinant bacmid to produce recombinant baculovirus. Full-length recombinant hZP3 (amino acids 1-424) and truncated recombinant hZP3 (amino acids 23-348) were expressed in the sf9 cells by infection with the recombinant baculovirus. The expression time of hZP3 was determined by Western blot and its purification was explored.The recombinant bacmid and baculovirus were successfully constructed for expressing both the full-length and truncated hZP3. The maximal expression of recombinant hZP3 in the sf9 cells was achieved at 72-96 hours after baculovirus infection. Some of the recombinant hZP3 with His-tag could bind affinity matrix and got purified but most of the solubilized hZP3 passed through and the reasons remained unknown. Purified recombinant hZP3 labeled with Dylight Dye488 was able to bind human sperm.It is feasible to express recombinant hZP3 in insect cells using the baculovirus system though the yield of hZP3 needs to be optimized. The methods for efficient enrichment and purification of recombinant hZP3 require further exploration.
Sf9
Baculoviridae
FLAG-tag
Cite
Citations (0)
Мета. Покращення результатів лікування хворих з місцево-розповсюдженими та рецидивними солідними пухлинами черевної порожнини та заочеревинного простору.
Матеріали і методи. За період з червня 2015 по січень 2018 р. в Національному інституті раку виконали комбіновані оперативні втручання з нефректомією 28 хворим з приводу первинних місцево-розповсюджених та рецидивних солідних пухлин черевної порожнини та заочеревинного простору.
Результати. У 5 із 28 пацієнтів виконали нефректомію ex vivo ex situ з аутотрансплантацією нирки, у 4 - успішно. Гостре ушкодження нирок спостерігали у 6 (26%) хворих, яким аутотрансплантації нирки не виконували. Після операції померли 2 (8,7%) хворих. У пацієнтів, яким нирка була збережена, не спостерігали гострого ушкодження нирок, ніхто з цих пацієнтів не помер.
Висновки. З метою профілактики розвитку гострого ушкодження та хронічної хвороби нирок у майбутньому можливість виконання аутотрансплантації нирки у разі хірургічного лікування солідних пухлин черевної порожнини та заочеревинного простору, окрім первинного раку нирки, повинна бути розглянута щодо кожного хворого. Дану процедуру доцільно виконувати в спеціалізованих лікувальних закладах, де накопичено досвід в онковаскулярній хірургії.
Ex vivo
Ex situ conservation
Cite
Citations (0)
Objective To express BPI 23 Fcγ1 anti bacteria recombinant fusion protein. Methods BPI 23 and Fcγ1 genes were isolated by RT PCR from HL 60 and normal human leukocytes and inserted into expression vector pBV and the fusion protein expressed in E. coli DH5α in a temperature induced manner. Results The expressed BPI 23 Fcγ1 fusion protein constituted 20%～30% of total bacterial protein. The renatured BPI 23 Fcγ1 recombinant protein showed biological activities of anti bacteria and was able to form conjugate with protein A. Conclusion pBV BPI 600 Fcγ1 700 recombinant expression vector was successfully constructed, and BPI 23 Fcγ1 recombinant protein with anti bacteria activities was expressed in E. coli .
Protein A/G
Myc-tag
Target protein
Protein G
Cite
Citations (0)
This chapter contains section titled: Hematopoiesis, Hematology, and Hemostasis Immune System Inflammation Ex Vivo Living Systems Cardiovascular: Ex Vivo Hepatic: Ex Vivo Hematopoietic: Lymphocytes (EX VIVO) Hematopoietic: Macrophages and Monocytes (EX VIVO) Hematopoietic: Neutrophils (EX VIVO) Hematopoietic: Platelets (EX VIVO) Hematopoietic: Red Blood Cells (EX VIVO) Musculoskeletal: Ex Vivo Neoplastic Disease: Ex Vivo Respiratory: Ex Vivo
Ex vivo
Cite
Citations (0)
[Objective] To study the function of ULBP3 and express the ULBP3 extracellular domain recombinant fusion protein. [Methods] The extracellular domain of ULBP3 cDNA was cloned into the recombinant pET28a-chaperonin10 prokaryotic expression vector to construct a recombinant pET28a-chaperonin10-ULBP3 prokaryotic expression vector with ULBP3 cDNA fused to the hydroxy end of chaperonin10 gene. Then the recombinant plasmid was transduced into E.Coli. expression host BL21(DE3), the expression of fusion protein was induced by IPTG, and identified by Western blot. [Results] recombinant pET28a-chaperonin10-ULBP3 plasmid was constructed successfully and recombinant fusion protein chaperonin10-ULBP3 was identified by SDS-PAGE and Western blot. [Conclusion] The ULBP3 extracellular domain recombinant fusion protein was expressed in BL21(DE3) stably.
FLAG-tag
Myc-tag
Cite
Citations (0)
A few years ago, a promising optical device was created that could aid in the intraoperative localization of tumor tissue. Its discriminatory capacity for colorectal cancer tissue was investigated at the NKI-AVL. Measurements on healthy and malignant tissue were performed in and ex vivo. It was proposed to continue with only ex vivo measurements. Advantages of this approach were an increased reproducibility between measurements, easier inclusion and planning, and no need to interfere with the surgical procedure. The aim of this investigation was to validate whether the ex vivo measurements are comparable to in vivo measurements. A literature study showed that there is no clear consensus on the exact differences between in and ex vivo optical measurements (of colorectal tissues). From our statistical analysis and comparison of spectra, significant differences were found in the ex vivo measurements compared to in vivo measurements. These were mainly attributed to the loss of blood and water. The effects of these changes could be minimized if only the near-infrared (NIR) part of the spectrum is used. The fat parameters were uninfluenced in ex vivo measurements. It is therefore recommended to focus on fat and water dependent parameters obtained from NIR spectra.
Ex vivo
Cite
Citations (0)
Το πολλαπλούν μυέλωμα (ΠΜ) είναι μια αιματολογική κακοήθεια, η οποία χαρακτηρίζεται από συσσώρευση κακοήθων πλασματοκυττάρων στο μυελό των οστών (ΜΟ). Επιπρόσθετα με τις γενετικές ανωμαλίες οι οποίες εμφανίζονται στους κλώνους ΠΜ, τα πλασματοκύτταρα επηρεάζονται και από το μικροπεριβάλλον του καρκίνου. Αρκετές εργαστηριακές μελέτες έχουν καταδείξει υποσχόμενους παράγοντες, που όμως δεν έχουν οδηγήσει σε κλινικό όφελος. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε περιορισμούς κατά την ex vivo δοκιμή του φαρμάκου, η οποία πιθανώς να έχει γίνει χωρίς το μικροπεριβάλλον της νόσου, αλλά και την έλλειψη της προσομοίωσης της τρισδιάστατης αρχιτεκτονικής του περιβάλλοντος του ΜΟ. Συνεπώς, ο χαρακτηρισμός της αποτελεσματικότητας των νέων παραγόντων θεραπείας δεν θα πρέπει μόνο να εκτιμά την άμεση επίδρασή τους στα μυελωματικά κύτταρα, αλλά να λαμβάνει υπόψιν και το συνολικό μικροπεριβάλλον της νόσου. Βασικός σκοπός της διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη του μικροπεριβάλλοντος στο ΠΜ και η διερεύνηση των υποπληθυσμών που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε αυτό. Στο πλαίσιο αυτό, αρχικά διερευνήθηκαν τα υπάρχοντα μοντέλα μελέτης στο ΠΜ υπό το πρίσμα της κλινικής αξιοποίησης. Στη συνέχεια, έγινε de novo κατασκευή τρισδιάστατου ex vivo μοντέλου μελέτης με σκοπό τη διερεύνηση της προστατευτικής δράσης του μικροπεριβάλλοντος στα μυελωματικά κύτταρα υπό την επίδραση θεραπευτικών παραγόντων. Τέλος, με ευρεία ανοσοφαινοτύπηση σε δείγματα ΜΟ και περιφερικού αίματος (ΠΑ) ασθενών με ΠΜ, διευρύναμε την αναζήτηση υποπληθυσμών και αναζητήθηκαν συσχετίσεις με τις διαγνωστικές και θεραπευτικές πληροφορίες των ασθενών. Κατά τη διερεύνηση των δημοσιευμένων ex vivo μοντέλων μελέτης τέθηκαν κριτήρια τα οποία πληρούνταν στο σύνολό τους, ώστε το προτεινόμενο μοντέλο να θεωρείται ότι προσομοιάζει το μικροπεριβάλλον της νόσου, αλλά και να δύναται να αξιοποιηθεί κλινικά. Τελικώς επιλέχθηκαν 15 δημοσιεύσεις οι οποίες πληρούσαν όλα τα κριτήρια και περιλάμβαναν μοντέλα με ικριώματα γέλης, μοντέλα στερεών ικριωμάτων, μοντέλα βιοαντιδραστήρα, μοντέλα μικρορευστότητας (microfluidics) και μοντέλα με χρήση πειραματόζωων. Υπό αυτά τα δεδομένα αποφασίσθηκε η δοκιμή ικριωμάτων γέλης και στερεών ικριωμάτων. Για την πειραματική κατασκευή του ex vivo μοντέλου αξιοποιήθηκαν οι μυελωματικές κυτταρικές σειρές U266 και H929, ενώ με χρήση μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων μυελικής προέλευσης (ΒΜ-MSCs) από ασθενείς με ΠΜ μοντελοποιήθηκε το μικροπεριβάλλον της νόσου. Οι θεραπευτικοί παράγοντες που επιλέχθηκαν ήταν η δοξορουβικίνη (ανθρακυκλίνη) και η βορτεζομίμπη (αναστολέας πρωτεασώματος). Αρχικά μελετήθηκε η ανάπτυξη των μυελωματικών κυτταρικών, η συγκέντρωση ημίσειας αναστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (IC50) από τους παράγοντες και έγινε απομόνωση και καλλιέργεια πρωτογενών ΒΜ-MSCs. Στη συνέχεια αξιολογήθηκαν μέθοδοι μέτρησης βιωσιμότητας των μυελωματικών κυττάρων, δηλαδή η μέθοδος ΜΤΤ, η κυτταρομετρία ροής, η οπτική μέτρηση και ο αλγόριθμος αναγνώρισης εικόνας. Ο αλγόριθμος αναγνώρισης εικόνας αναπτύχθηκε ειδικά για αυτή την εφαρμογή και με τη χρήση του καταμετρώνται τα κύτταρα που έχουν χρωσθεί με κυανούν του τρυπανίου. Συμπερασματικά, διαπιστώθηκε ότι ανάλογα με τις πειραματικές συνθήκες όλες οι μέθοδοι εκτίμησης της βιωσιμότητας των μυελωματικών κυττάρων μπορούν να αξιοποιηθούν κατά περίπτωση. Στη συνέχεια, επιχειρήθηκε η κατασκευή καλλιεργειών με χρήση υδρογέλης, αλλά λόγω δυσκολίας στη μέτρηση της βιωσιμότητας των συγκαλλιεργειών στα ικριώματα υδρογέλης, συνεχίσαμε την ανάπτυξη του μοντέλου με στερεά ικριώματα γαλακτικού οξέως (PLA). Τα ικριώματα PLA που χρησιμοποιήθηκαν είχαν δομή πλέγματος με μέγεθος πόρου από 60 έως 120 μΜ και τοποθετήθηκαν σε μικροπλάκες 96 φρεατίων. Mε χρήση συνεστιακής μικροσκοπίας και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης διαπιστώθηκε ότι τα BM-MSCs αναπτύσσονται στα ικριώματα, εκτεινόμενα ανάμεσα στις ίνες του πλέγματος, επομένως μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στο ex vivo μοντέλο. Έχοντας μελετήσει τα επιμέρους στοιχεία, το συνολικό ex vivo μοντέλο που περιλαμβάνει ικριώματα PLA, δοκιμάσθηκε με την κυτταρική σειρά H929 σε συγκαλλιέργεια με BM-MSCs και υπό την επίδραση βορτεζομίμπης, και σε όλους τους τύπους ικριωμάτων διαπιστώθηκε μεγαλύτερη βιωσιμότητα των μυελωματικών κυττάρων συγκριτικά με τη δισδιάστατη μονοκαλλιέργεια. Επεκτείνοντας τη μελέτη μας πέραν των μεσεγχυματικών κυττάρων, προχωρήσαμε σε ευρεία ανοσοφαινοτύπηση του μικροπεριβάλλοντος χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Εξετάσθηκε διεξοδικά το ανοσολογικό προφίλ 94 ασθενών με ΠΜ, διερευνώντας κυτταρικούς υποπληθυσμούς μεταξύ των οποίων τα Β και Τ λεμφοκύτταρα και τους υποπληθυσμούς τους, τα Tregs, τα ΝΚ κύτταρα, και τα κατασταλτικά κύτταρα μυελικής προέλευσης (MDSCs). Ταυτόχρονα, αξιοποιήθηκε η πληροφορία για την ύπαρξη ελάχιστης υπολειμματικής νόσου (ΕΥΝ), καθότι οι ασθενείς που συμπεριελήφθησαν στη μελέτη είχαν ελεγχθεί με κυτταρομετρία ροής επόμενης γενιάς για την παρουσία ΕΥΝ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του EuroFlow. Επίσης, ελέγχθηκαν πιθανοί συσχετισμοί των υποπληθυσμών με τα διάφορα στάδια της νόσου, το κυτταρογενετικό προφίλ και την ανταπόκριση των ασθενών στην εισαγωγική θεραπεία. Από την αρχική ανάλυση σε δείγματα ΜΟ διαπιστώθηκε ότι η σύσταση του μικροπεριβάλλοντος του ΜΟ δεν εμφανίζει σημαντικές διαφορές στα διάφορα στάδια εξέλιξης του ΠΜ (MGUS, υφέρπον μυέλωμα, ΠΜ, πλασματοκυτταρική λευχαιμία και ΠΜ σε πλήρη ύφεση), ενώ το περιβάλλον του ΜΟ δεν αντικατοπτρίζει το περιβάλλον του ΠΑ σε ζεύγη δειγμάτων ΜΟ-ΠΑ των ίδιων ασθενών. Εξετάζοντας τις προγνωστικές πληροφορίες, βρέθηκε ότι το ανοσολογικό προφίλ διαφέρει στις διάφορες προγνωστικές ομάδες σύμφωνα με το διεθνές σύστημα σταδιοποίησης στο ΠΜ (ISS), αλλά και με το κυτταρογενετικό προφίλ. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η απάντηση στη θεραπευτική αντιμετώπιση και βρέθηκε ότι σχετίζεται με συγκεκριμένη ανοσολογική υπογραφή κατά τη διάγνωση, ενώ αναλύοντας το ανοσολογικό προφίλ του ΜΟ μετά τη θεραπεία, διαπιστώθηκε ότι οι ασθενείς αρνητικοί για την παρουσία ΕΥΝ, έχουν ξεχωριστή ανοσολογική υπογραφή. Τέλος, αναλύοντας το ΠΑ ασθενών κατά την πλήρη ύφεση, βρέθηκε ότι το ποσοστό των παρθένων και των δραστικών/δραστικών-μνήμης CD4+ T λεμφοκυττάρων σχετίζονται με αρνητική ΕΥΝ και επιπλέον, κατασκευάσαμε έναν υπολογιστικό αλγόριθμο, όπου με βάση την έκφραση αυτών των υποπληθυσμών σε ανεξάρτητη ομάδα 20 ασθενών, επιτεύχθηκε η πρόβλεψη της ΕΥΝ με ευαισθησία 86% και ειδικότητα 85%. Συνολικά, στο πλαίσιο αυτής της διατριβής κατασκευάστηκε ex vivo πλατφόρμα εξατομικευμένης εκτίμησης της ανταπόκρισης στη θεραπεία ασθενών με ΠΜ, η οποία δύναται να χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω μελέτες και διερευνήθηκαν οι κυτταρικοί υποπληθυσμοί στο περιβάλλον της νόσου. Δείχθηκε ότι το ανοσολογικό μικροπεριβάλλον στο ΠΜ είναι δυναμικό και αποκτά διακριτά ανοσολογικά προφίλ στα διάφορα στάδια της νόσου όπως και στις διάφορες προγνωστικές ομαδοποιήσεις των ασθενών. Επιπλέον, αναδείχθηκε η ύπαρξη ανοσολογικής υπογραφής προγνωστικής αξίας, σχετιζόμενης με τη θεραπευτική ανταπόκριση και την παρουσία ΕΥΝ. Φαίνεται ότι η εξατομικευμένη ανάλυση του ανοσολογικού προφίλ στο ΠΜ μπορεί να συμβάλλει θετικά στη βελτιστοποίηση της θεραπευτικής διαδρομής των ασθενών.
Ex vivo
Cite
Citations (0)
Ex vivo
Cite
Citations (0)
Magnetic resonance imaging (MRI) is a non-destructive technique that is capable of localizing pathologies and assessing other anatomical features (e.g., tissue volume, microstructure, white matter connectivity) in postmortem, ex vivo human brains. However, when brains are removed from the skull and cerebrospinal fluid (i.e., their normal in vivo magnetic environment), air bubbles and air-tissue interfaces typically cause magnetic susceptibility artifacts that severely degrade the quality of ex vivo MRI data. In this report, we describe a relatively simple and cost-effective experimental set-up for acquiring artifact-free ex vivo brain images using a clinical MRI system with standard hardware. In particular, we outline the necessary steps, from collecting an ex vivo human brain to the MRI scanner setup, and have also described changing the formalin (as might be necessary in longitudinal postmortem studies). Finally, we share some representative ex vivo MRI images that have been acquired using the proposed setup in order to demonstrate the efficacy of this approach. We hope that this protocol will provide both clinicians and researchers with a straight-forward and cost-effective solution for acquiring ex vivo MRI data from whole postmortem human brains.
Ex vivo
Artifact (error)
Human brain
Cite
Citations (43)
Aim:To construct the recombinant plasmid pPIH encoding IL-2-human serum album(HSA) fusion protein, express it in Pichia pastria, and to obtain the IL-2-HSA with IL-2 bioactivity. Methods: The cDNA encoding human IL-2 was obtained by RT-PCR from human peripheral blood mononuclear cells. The two cDNA fragments encoding human IL-2 and HSA respectively were spliced by overlap PCR extension, and the fusion gene was then cloned into the expression vector pPIC9K to obtain the recombinant plasmid pPIH. The recombinant P. pastria determined was obtained by electrotransformation of pPIH into P. pastria KM71. The bioactivity of the supernatant containing the fusion protein IL-2-HSA was assayed by CTLL-2/MTT method. Results: The recombinant plasmid pPIH was successfully constructed, and the fusion protein IL-2-HSA was well expressed from pPIH with methanol induction at 30℃ for 3 d. It was found that the bioactivity of the fermentation supernatant was about 100 U/mL. Conclusion: The recombinant fusion protein of IL-2-HSA with IL-2 bioactivity was successfully obtained. The proposed method for the recombinant fusion protein of IL-2-HSA has not been reported.
Pichia
Cite
Citations (1)