The Catalytic Activity of GSTM1 In vitro is Independent of MAPK8
Shannon RobinKhalil Ben HassineSimona Jurković MlakarVid MlakarMarc AnsariChakradhara Rao S. Uppugunduri
1
Citation
2
Reference
10
Related Paper
Citation Trend
Abstract:
Background: Glutathione S-transferases (GSTs) are phase II metabolic enzymes crucial for the metabolism of electrophilic drugs. Additionally, several GST isoforms are involved in protein- protein interaction with mitogen-activated protein kinases (MAPKs), modulating apoptosis pathways. Methods: To assess the potential change of enzymatic activity, we performed a GST enzyme assay with human recombinant GSTM1 in the presence and absence of MAPK8. Recently, GSTM1 has been demonstrated to interact with MAPK8 both in silico and in vitro. The binding interface predicted in silico comprised amino acid residues present on the surface of the protein and a few were deep in the active site of the protein. Results: The experiment demonstrated that the GSTM1 activity was conserved even in the presence of MAPK8 in the assay. Conclusion: The possible alteration in the activity of MAPK8 in this interaction needs to be evaluated in further experiments.Keywords:
Glutathione S-transferase
To investigate the methods and solve the technical bottlenecks in the preparation of recombinant human protein hZP3 using the baculovirus expression system and pave the technical ground for the production and application of recombinant hZP3.The recombinant vector pFASTBAC HTa-hZP3 was constructed and transferred to competent E. coli cells carrying bacmid to produce recombinant bacmid by homologous recombination. Sf9 cells were transfected with the recombinant bacmid to produce recombinant baculovirus. Full-length recombinant hZP3 (amino acids 1-424) and truncated recombinant hZP3 (amino acids 23-348) were expressed in the sf9 cells by infection with the recombinant baculovirus. The expression time of hZP3 was determined by Western blot and its purification was explored.The recombinant bacmid and baculovirus were successfully constructed for expressing both the full-length and truncated hZP3. The maximal expression of recombinant hZP3 in the sf9 cells was achieved at 72-96 hours after baculovirus infection. Some of the recombinant hZP3 with His-tag could bind affinity matrix and got purified but most of the solubilized hZP3 passed through and the reasons remained unknown. Purified recombinant hZP3 labeled with Dylight Dye488 was able to bind human sperm.It is feasible to express recombinant hZP3 in insect cells using the baculovirus system though the yield of hZP3 needs to be optimized. The methods for efficient enrichment and purification of recombinant hZP3 require further exploration.
Sf9
Baculoviridae
FLAG-tag
Cite
Citations (0)
Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής μελετήθηκαν οι επιστημονικοί τομείς της Βιοπληροφορικής, της Υπολογιστικής Συστημικής Βιολογίας και της Μηχανικής Μάθησης με στόχο την αξιοποίησή τους σε προβλήματα του έντονα αναπτυσσόμενου και εξελισσόμενου χώρου της In Silico Ογκολογίας. Ο χώρος αυτός θέτει ως βασικό στόχο την ανάπτυξη υπολογιστικών μοντέλων ικανών να προσομοιώσουν την ανάπτυξη αλλά και την απόκριση στη θεραπεία καρκινικών όγκων. Κομβική συμμετοχή σε αυτές τις προσπάθειες έχει η Ομάδα για την In Silico Ογκολογία και την In Silico Ιατρική του Ερευνητικού Πανεπιστημιακού Ινστιτούτου Συστημάτων Επικοινωνιών και Υπολογιστών του Εθνικού Μετσόβιου Πολυτεχνείου (ΕΠΙΣΕΥ-ΕΜΠ) μέσω των πολυετών προσπαθειών ανάπτυξης μιας οικογένειας μοντέλων, των Ογκοπροσομοιωτών. Οι συγκεκριμένοι Ογκοπροσομοιωτές εστιάζουν κυρίως στην προσομοίωση των φαινομένων στο κυτταρικό και σε ανώτερα αυτού επίπεδα. Στην παρούσα διατριβή αναζητήθηκαν τα σημεία εκείνα όπου μέθοδοι της Βιοπληροφορικής, της Υπολογιστικής Συστημικής Βιολογίας και της Μηχανικής μάθησης μπορούν να συμβάλλουν στην εξειδίκευση των Ογκοπροσομοιωτών και στον μοριακό χώρο αλλά και στην αξιοποίησή τους για προβλεπτικές διαδικασίες σχετικά με την εξατομικευμένη απόκριση καρκινικών όγκων σε θεραπεία Προκειμένου να παρουσιαστούν οι δυνατότητες αυτές, επιλέχθηκαν συγκεκριμένες εφαρμογές και δόθηκε εστίαση στην περίπτωση της Οξείας Λεμφοβλαστικής Λευχαιμίας μέσω της χρήσης και μελέτης της επεκτασιμότητας του Ογκοπροσομοιωτή Λευχαιμίας. Συγκεκριμένα, αναπτύχθηκαν και εκπαιδεύτηκαν μέσω μεθόδων βελτιστοποίησης ένα μοντέλο Συστημικής Βιολογίας για την προσομοίωση της βιοχημικής ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου στην Οξεία Λεμφοβλαστικής Λευχαιμίας και ένα μοντέλο προσομοίωσης της Φαρμακοκινητικής για το φάρμακο Πρεδνιζόνη, ικανά να τροφοδοτήσουν με πληροφορία τον Ογκοπροσομοιωτή. Επίσης μέσω μεθόδων Βιοπληροφορικής και Μηχανικής Μάθησης αναπτύχθηκε το Υβριδικό Σύστημα Ογκοπροσομοιωτή Λευχαιμίας, δηλαδή διαδικασίες για την αυτοματοποιημένη προσαρμογή του Ογκοπροσομοιωτή σε δεδομένα ασθενών αλλά και την πρόβλεψη της απόκρισης νέων ασθενών σε θεραπεία μέσω εκπαίδευσης επιμέρους μοντέλων μηχανικής μάθησης. Συγκεκριμένα, επιχειρήθηκε η πρόβλεψη της απόκρισης στην Πρεδνιζόνη, ασθενών με Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμίας, παιδικής ηλικίας, η οποία αποτελεί βασική πληροφορία για την διαστρωμάτωση των ασθενών σε ομάδες κινδύνου. Η πρωτότυπη προσπάθεια και η επαρκής επιτυχία πρόβλεψης μέσω του Υβριδικού Ογκοπροσομοιωτή αποτελούν σημαντικό βήμα για την περαιτέρω ανάπτυξη του χώρου της In Silico Ογκολογίας.
Cite
Citations (0)
In the livers of rats treated with phenobarbital an increase of glutathione-S-transferase and glutathione is observed. The results suggest that phenobarbital could alter the disposition of certain toxic not only by increasing the rate of formation of less toxic metabolites, but also by increasing the amount of glutathione available for GSH-S-transferase that is involved in the formation of less toxic glutathione conjugates.
Phenobarbital
Glutathione S-transferase
Glutathione transferase
Transferase
Cite
Citations (0)
The application of structure-based in silico methods to drug discovery is still considered a major challenge, especially when the x-ray structure of the target protein is unknown. Such is the case with human G protein-coupled receptors (GPCRs), one of the most important families of drug targets, where in the absence of x-ray structures, one has to rely on in silico 3D models. We report repeated success in using ab initio in silico GPCR models, generated by the predict method, for blind in silico screening when applied to a set of five different GPCR drug targets. More than 100,000 compounds were typically screened in silico for each target, leading to a selection of <100 “virtual hit” compounds to be tested in the lab. In vitro binding assays of the selected compounds confirm high hit rates, of 12–21% (full dose–response curves, K i < 5 μM). In most cases, the best hit was a novel compound (New Chemical Entity) in the 1- to 100-nM range, with very promising pharmacological properties, as measured by a variety of in vitro and in vivo assays. These assays validated the quality of the hits as lead compounds for drug discovery. The results demonstrate the usefulness and robustness of ab initio in silico 3D models and of in silico screening for GPCR drug discovery.
Cite
Citations (146)
Вступ. Об’єктом представленого дослідження є атристамін (2-метил-3-(феніламінометил)-1Н-хінолін-4-он), який вивчають як перспективний антидепресант із церебропротекторними, ноотропними, аналгетичними, антигіпоксичними та актопротекторними властивостями. Обов’язковою умовою подальшого впровадження його як кандидата в ліки є дослідження фармакокінетичних характеристик молекули. Це неможливо здійснити без цілісного розуміння процесів біотрансформації, яким піддається досліджувана сполука в організмі людини.
Мета дослідження – провести in silico дослідження можливих шляхів метаболізму перспективного антидепресанта атристаміну за допомогою онлайн-ресурсів, що перебувають у вільному доступі.
Методи дослідження. З метою in silico дослідження можливих напрямків біотрансформації атристаміну в організмі людини використовували он-лайн такі веб-сервіси: “Xenosite P450 Metabolism 1.0”; “Xenosite UGT 2.0”; “Way2Drug SOMP” та “Way2Drug RA”. З огляду на те, що структурною особливістю хінолін-4(1Н)-онів є можливість існування прототропної таутомерії в гетероциклі, обчислення проводили для обох теоретично можливих таутомерних форм молекули атристаміну – 2-метил-3-(феніламінометил)-1Н-хінолін-4-ону та 4-гідрокси-2-метил-3-(феніламінометил)-хіноліну.
Результати й обговорення. Наявність вторинної аміногрупи в молекулі 2-метил-3-(феніламінометил)-1Н-хінолін-4-ону і 4-гідроксигрупи в молекулі іншого таутомера (4-гідрокси-2-метил-3-(феніламінометил)-хіноліну) зумовлює високу ймовірність глюкуронування з утворенням, відповідно, N- та О-глюкуронідів. Для 2-метил-3-(феніламінометил)-1Н-хінолін-4-ону як більш стійкої форми показано, що основними шляхами метаболізму можуть бути ароматичне гідроксилювання, аліфатичне гідроксилювання, окиснювальне дезамінування, N-гідроксилювання та епоксидування. Найбільшої уваги заслуговує напрямок аліфатичного гідроксилювання, оскільки, на відміну від усіх інших шляхів, у результаті цього прогнозується утворення генерації метаболітів з новими фармакологічними властивостями (похідні кінуренової кислоти).
Висновок. Результати in silico дослідження можливих шляхів метаболізму атристаміну в організмі людини свідчать на користь того факту, що досліджувана сполука з високою ймовірністю інтенсивно метаболізується з участю ензимних систем цитохрому P450, що обов’язково необхідно врахувати в подальшому при плануванні експериментів in vivo.
Cite
Citations (0)
Предложено для более точной оценки in silico показателей ADMET лекарственных веществ использовать мультипликативную функцию принадлежности. Применимость новой метрики показана на примере прогноза кардиотоксичности. На платформе Drug Bank найдены три препарата с известной кардиотоксической активностью (Амиодарон, Флуоксетин, Терфенадин) и три препарата, не проявляющие кардиотоксических свойств (Папаверин, Пиридоксин, Левофлоксацин). С помощью программы PASS и on-line ресурса ADMET-PreServ Осуществлен мультипликативный и простой консенсусный прогноз кардиотоксических свойств шести указанных референсных препаратов и десяти новых соединений. Проведено сравнение прогностической способности двух метрик. Показано, что мультипликативная функция принадлежности как метрика оценки in silico наличия у химических соединений кардиотоксических свойств является более предпочтительной, чем простая консенсусная оценка. Разработанная метрика может быть рекомендована для оценки in silico других ADMET характеристик.
Cite
Citations (0)
Alkylating agents can be detoxified by conjugation with glutathione (GSH). One of the physiological significances of this lies in the observation that cancer cells resistant to the cytotoxic effects of alkylating agents have higher levels of GSH and high glutathione S-transferase (GST) activity. However, little is known about the GSH-/GST-dependent biotransformation of alkylating agents, including cyclophosphamide. Cyclophosphamide becomes cytostatic after the enzymatic formation of 4-hydroxycyclophosphamide. The ultimate alkylating species formed from cyclophosphamide is phosphoramide mustard. In this paper we describe the involvement of purified human glutathione S-transferases isoenzymes GST A1-1, A2-2, M1a-1a, and P1-1 in the formation of two types of glutathionyl conjugates of cyclophosphamide, i.e., 4-glutathionylcyclophosphamide (4-GSCP) and monochloromonoglutathionylphosphoramide mustard. When 0.1 mM 4-hydroxycyclophosphamide and 1 mM GSH was incubated in the presence of 10 microM GST A1-1, A2-2, M1a-1a, and P1-1 the formation of 4-GSCP was 2-4-fold increased above the spontaneous level. Enzyme kinetic analysis demonstrated the lowest Km (0.35 mM) for GST A1-1. Km values for the other GST enzymes ranged from 1.0 to 1.9 mM. Glutathione S-transferase A1-1 (40 microM) also increased the conjugation of phosphoramide mustard and GSH (both 1 mM) 2-fold, while the other major human isoenzymes, A2-2, M1a-1a, and P1-1, did not influence the formation of monochloromonoglutathionylphosphoramide mustard. These results indicate that only one enzyme within the class of human GST alpha enzymes was able to catalyze the reaction of the aziridinium ion of phosphoramide mustard with glutathione. Thus increased levels of GST A1-1 in tumor cells can contribute to an enhanced detoxification of phosphoramide mustard and hence to the development of drug resistance. Since all of the human GSTs tested did catalyze the formation of 4-GSCP, the role of 4-GSCP either as a transport form of activated cyclophosphamide or as a detoxification product is discussed.
Glutathione S-transferase
Nitrogen mustard
Cite
Citations (162)
A large-scale in silico evaluation of gene deletions in Saccharomyces cerevisiae was conducted using a genome-scale reconstructed metabolic model. The effect of 599 single gene deletions on cell viability was simulated in silico and compared to published experimental results. In 526 cases (87.8%), the in silico results were in agreement with experimental observations when growth on synthetic complete medium was simulated. Viable phenotypes were correctly predicted in 89.4% (496 out of 555) and lethal phenotypes were correctly predicted in 68.2% (30 out of 44) of the cases considered. The in silico evaluation was solely based on the topological properties of the metabolic network which is based on well-established reaction stoichiometry. No interaction or regulatory information was accounted for in the in silico model. False predictions were analyzed on a case-by-case basis for four possible inadequacies of the in silico model: (1) incomplete media composition, (2) substitutable biomass components, (3) incomplete biochemical information, and (4) missing regulation. This analysis eliminated a number of false predictions and suggested a number of experimentally testable hypotheses. A genome-scale in silico model can thus be used to systematically reconcile existing data and fill in our knowledge gaps about an organism.
Cite
Citations (138)
The relationship between reduced glutathione (GSH) level and glutathione S-transferase (GST) activity in erythrocytes was examined, using sheep erythrocytes, which have varying GSH concentrations, and dog erythrocytes with an inherited high concentration of GSH. There was a positive correlation (r = 0.529, p < 0.001) between the GSH level and GST activity in sheep erythrocytes. In dog erythrocytes, the GST activity in high-GSH cells was significantly (p < 0.001) higher than that in normal-GSH cells. These results indicate that the activity of GST in erythrocytes is directly correlated with the intracellular GSH level.
Glutathione S-transferase
Glutathione transferase
Cite
Citations (9)
Glutathione S-transferase
Transferase
Cite
Citations (8)