Amphipathic chitosans improve the physicochemical properties of siRNA-chitosan nanoparticles at physiological conditions
Grazieli Olinda MartinsMaicon Segalla PetrônioAline Margarete Furuyama LimaAndré Miguel MartinezVera Aparecida de Oliveira TieraMarília Freitas CalmonPatrícia Simone Leite VilamaiorSang Won HanMárcio José Tiera
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Abstract:
Chitosan has received a lot of attention as a carrier for small interfering RNA (siRNA), due to its capacity for complexation and intracellular release of these molecules. However, one of its limitations is its insolubility at neutral pH and the tendency towards aggregation of its nanoparticles in isotonic ionic strength. In this study, a series of amphipathic chitosans were synthesized by varying the degree of acetylation (DA) from ˜2 to ˜30 mol% and the degree of substitution (DS) from 5 to 25%. by tertiary amino groups (DEAE) The results showed that the adjustment of these parameters decreases the interparticle interactions mediated by hydrogen bonding to obtain nanoparticles with improved colloidal stability. siRNA-containing nanoparticles of 100 to 150 nm with low polydispersities (0.15–0.2) and slightly positive zeta potentials (˜+ 5 mV) were resistant to aggregation at pH 7.4 and ionic strength of 150 mM. This resistance to aggregation is provided by changes on the nanoparticle surface and highlights the importance of more organized self-assembly in providing colloidal stability at physiological conditions. Additionally, the PEGylation of the most promising vectors conferred favorable physicochemical properties to nanoparticles. The chitosans and their nanoparticles exhibited low toxicity and an efficient cell uptake, as probed by confocal microscopy of rhodamine labeled vectors. The results provide a new approach to overcome the limited stability of chitosan nanoparticles at physiological conditions and show the potential of these amphipathic chitosans as siRNA carriers.본 연구는 염장과정 중 무의 예열처리 및 chitosan의 첨가가 무의 조직감에 미치는 효과를 알아보기 위하여 압착시험, 침투관통시험 및 절단시험에 의해 조직감의 변화를 측정하고 펙틴질의 변화를 측정하였다. 또한 관능검사를 실시하고 무의 조직감에 대한 관능적 평가와 기계적 측정치와의 관련성을 조사하였다. 그 결과는 다음과 같다. 1. 비 열처리구에 있어서 chitosan 첨가군의 압착변형력은 대조군의 압착변형력에 비해 높은 것으로 나타났다. 열처리구에 있어서는 각 첨가군들의 압착변형력은 염장이 진행됨에 따라 감소하는 경향을 보였다(p<0.05). 침투관통력은 대조군과 chitosan 첨가군에서 모두 감소하였으나 chitosan 첨가군이 보다 높은 침투관통력을 나타내었다(p<0.05). 절단력은 비 열처리구에서 염장이 시작되면서 증가하여 염장기간 내내 높은 절단력을 유지하였으며, 특히 chitosan 첨가군의 절단력은 염장과정 중 크게 증가하였다. 열처리구의 절단력은 대조군에서는 염장 초기에 급격히 증가한 후 염장 4일째부터 크게 감소하였으나, chitosan 첨가군은 염장기간 내내 비슷한 수준을 유지하였다. 2. 대조군의 HWSP는 염장 2일째까지 감소하다가 증가하였으며 HXSP는 염장 2일째까지 증가하다가 이 후 계속 감소하였으나 생무보다는 높은 함량을 나타내었다. HCISP는 염장과정 중 계속 감소하였다. 그러나 열처리에 의해서 HXSP는 감소하였다. 한편 chitosan 첨가군의 HWSP는 계속 감소하였으며 HXSP와 HCISP는 계속 증가하였는데 이때 HCISP의 증가가 더욱 뚜렷하였다. 또한 열처리구도 같은 경향을 나타내었다(p<0.05). 3. 염장과정 중 비 열처리구의 단단한 정도와 아삭 아삭한 정도는 감소하였으나 질긴 정도는 증가된 것으로 평가되었다. 그러나 열처리구의 질긴 정도는 감소하였으며 chitosan 첨가에 의하여 무의 단단한 정도는 증가하였다(p<0.05). 한편, 압착변형력과 침투관통력은 무의 단단한 정도와 아삭아삭한 정도와 상관관계가 높았으며 절단력은 질긴 정도와 상관성이 다소 높게 나타났다(p<0.01). 이상의 결과로서 chitosan의 첨가는 비 열처리구와 열처리구에서 무의 조직감을 향상시킨 것으로 나타났다. 예열처리에 의한 효과는 담금 초기에 나타났으며 예절처리와 chitosan 첨가에 의한 병용 효과는 없는 것으로 나타났다.
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취반시 chitosan 첨가가 쌀밥의 저장 중 품질특성에 미치는 효과를 조사하기 위해 먼저 취반시 밥물에 0.1%와 0.5%의 키토산을 첨가하여 밥을 제조하여 관능검사를 실시한 결과, 쌀밥의 종합적 기호도는 0.1% chitosan 처리구와 대조구와 유사하였으나 0.5% chitosan 첨가구의 기호성은 감소하였다. 0.1% chitosan을 첨가한 밥에 Bacillus 포자를 인위적으로 접종하여 20℃와 30℃에 3일 동안 저장하면서 품질변화를 조사하였다. Chitosan 첨가구의 생균수는 저장기간 동안 대조구에 비해 20oC에서는 약 1～1.5 log cycle, 30℃에서는 약 0.5～1 log cycle정도 낮았다. 대조구와는 달리 chitosan 첨가구는 저장 2일째까지 pH의 뚜렷한 변화가 관찰되지 않았으며, 30oC에서는 대조구와 chitosan 첨가구 모두 pH가 점차 감소하였다. Hardness는 대조구와 chitosan 첨가구 사이에 뚜렷한 차이는 관찰되지 않았으며, 저장시간이 경과할수록 감소하였다. Cohesiveness는 chitosan 처리구와 대조구 모두 저장기간이 경과할수록 감소하였으며, chitosan 처리구의 cohesiveness가 대조구에 비해 저장 전 기간 동안 다소 높은 경향을 나타내었다. Chitosan첨가 쌀밥의 명도(L값)는 저장기간 동안 대조구에 비해 높았으며, b값은 낮게 나타났다.
Group cohesiveness
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생리활성 기능을 갖고 있으면서 지구상에 cellulose 다음으로 많이 존재하는 탄수화물인 chitin으로부터 쉽게 얻을 수 있는 chitosan의 김양식에 대한 처리효과를 조사하였다. 패각사상체 배양에 있어 패각에 chitosan을 처리하였을 때 처리하지 않은 패각에 비해 사상체의 부착이 현저히 높았다. 또한 30 cps, 90 cps chitosan을 처리한 후 비교하였을 때 30 cps chitosan 처리구의 사상체 부착율이 높은것으로 나타나 chitosan 종류에 따라 그 효과가 다름을 알 수 있었다. 이 결과는 채묘시 망에 chitosan 처리를 함으로써 망에 김 부착율을 높이고 결과적으로 다른 잡조류의 부착율을 떨어뜨릴 수 있다는 가능성을 보여주고 있다. 한편 실내 실험에서 엽체 배양에 chitosan을 처리한 결과 30 cps chitosan 처리구가 101.2%, 90 cps chitosan 처리구가 92.1%의 무게증가율을 보인 반면 control는 72.9%로 30 cps chitosan 처리구가 90 cps chitosan 처리구보다 9.1%, control 보다 28.3%의 증가율을 보였으며 90 cps chitosan 처리구도 comtrol 보다 19.2% 증가 하였으며 chitosan을 처리했을 때가 control 보다 훨씬 부드럽고 윤기가 좋았다. 이 결과는 김양식 중에 chitosan을 처리함으로써 수확량 증가와 품질개선효과도 볼 수 있다는 가능성을 보여주고 있다.
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Chiosan을 이용하여 필름을 제조하여 chilesan의 탈아세틸화도와 분자량, chitosan의 농도, pH등에 따른 chitosan 필름의 인장강도, 인장율 및 수분 투과도 등을 조사한 결과는 다음과 같다.
Chitosan 조제조건으로는 47% NaOH로 130℃에서 3시간이상 처리시켰을 때 탈아세틸화도의 변화는 적은데 비해 분자량의 감소는 크게 나타나 상업적으로 이용시 3시간 이하로 처리하는 것이 바람직하였다.
Chitosan의 탈아세틸화도, 분자량, pH, 농도에 따른 필름의 인장강도, 인장을 및 수분 투과도의 결과는 탈아세틸화도가 높아짐에 따라 인장강도, 인장을, 수분 투과도등은 감소하였으며, 분자량이 적어짐에 따라 인장강도, 인장을, 수분 투과도등은 감소하는 것으로 조사되었다. pH가 높아짐에 따라 인장강도와 수분 투과도는 감소하였으나 인장율에 있어서는 증가하는 것으로 나타났다. 그리고 chitosan 농도가 높아짐에 따라 인장율과 수분 투과도는 감소하였으나 인장강도는 증가하는 것으로 조사되었다.
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This chapter contains sections titled: General Properties of Chitosan Limitations of Chitosan Understanding the Biocide Properties of Chitosan Films Designing Water-Resistant Chitosan-Based Films Active Antimicrobial Packaging Based on Chitosan Chitosan-Based Systems in Biomedical Applications Future Perspectives References
Biocide
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This chapter contains sections titled: Introduction Biodegradability of Chitin and Chitosan Biocomapatibility and Toxicology of Chitin and Chitosan Chitosan as Antimicrobial Agent Chitosan as Haemostatic Agent Chitosan as Immunity Modulator Chitosan as Adjuvant Chitosan as Wound Healing Accelerator Chitosan as Lipid Lowering Agent & Dietary Supplement in Aid of Weight Loss Chitosan as Antioxidant Conclusion
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분해성 천연 고분자인 PHB와 chitosan을 블렌드하여 필름을 제조한 뒤 필름의 결정특성 및 물리적 성질을 측정한 결과 PHB/chitosan 필름의 X선 회절도 측정에서 상대 결정화도는 chitosan의 함량이 증가할수록 낮아졌으며 FT-IR 측정에서는 chitosan 비율이 증가할수록 PHB의 carbonyl기의 피크가 작아졌다. DSC 측정에 의한 필름의 열적 특성에서는 chitosan의 첨가로 인해 열안정성과 결정성이 낮아지는 경향을 보였다. 시차주사현미경을 이용하여 관찰한 필름의 표면상태에서는 chitosan의 비율이 증가할수록 입자크기가 감소하는 것으로 나타났다. 필름의 물성은 PHB에 대한 chitosan의 함량이 증가할수록 인장강도와 신장률이 증가하여 chitosan 첨가로 인해 필름의 물성이 향상된 것을 알 수 있었다. PHB/chitosan 필름의 색도 측정 결과 PHB에 chitosan의 함량이 증가할수록 L값과 b값은 낮아지고 필름의 투명도는 높아졌다.
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감식초의 청징화를 위하여 고분자와 저분자 chitosan을 여과전 단계의 감식초에 농도별로 처리하여 침전량, pH 및 총산, 탁도, 갈색도, 탄닌 함량, 가용성 고형분 함량, 색상 등의 변화를 비교하였다. 그 결과, 침전량은 chitosan의 첨가량이 많을수록 증가하였으나 분자량에 따른 차이는 크게 나타나지 않았다. pH 및 총산은 chitosan 처리에 의해 거의 영향을 받지 않았으나, 탁도는 chitosan 첨가량이 증가할수록 보다 효과적으로 감소하였다. 갈색도는 chitosan 첨가량이 증가할수록 감소하였으나 분자량간의 차이는 거의 없었다. 탄닌 및 가용성 고형분 함량은 chitosan 첨가에 의해 모두 감소하였으나 분자량에 따른 효과는 chitosan 농도에 따라 다소 차이가 있었다. 색상은 chitosan 농도가 증가할수록 L*값은 증가하는 반면 a*와 b*값은 감소하여 보다 밝고 연한 색상으로 변화하였다. 관능검사에서 색깔과 향은 chitosan 처리에 의해 영향을 받지 않았으나 떫은맛은 500 ㎎/L 첨가시 높은 값을 나타내어 결국 종합적인 기호도가 낮게 평가되었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, 감식초의 청징화 과정에서 고분자 또는 저분자 chitosan을 400 ㎎/L 농도로 처리함으로써 갈변이 억제되거나 또는 여과 시간의 단축에 따라 갈변이 최소화 될 것으로 여겨지며 또한 색상의 개선에도 효과적일 것으로 사료되었다.
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Chitosan is a polymer obtained by deacetylation of chitin, and chitin is one of the major components of the arthropod cuticle. Chitin and chitosan are both polysaccharides and are considered to be an interesting class of biosourced materials. This is evident as chitosan has already demonstrated utility in various applications in both industrial and biomedical domains. In the present work, we study the possibility to extract chitin and prepare chitosan from the Goliath beetle Goliathus orientalis Moser. The presented work includes description of this process and observation of the macroscopic and microscopic variations that occur in the specimen during the treatment. The prepared chitosan is characterized and compared with commercially available chitosan using infrared and thermogravimetric analysis. The deacetylation degree of prepared chitosan is also evaluated and compared with commercially available shrimp chitosan.
Thermogravimetric analysis
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생리활성 기능을 갖고 있으면서 지구상에 cellulose 다음으로 많이 존재하는 탄수화물인 chitin으로부터 쉽게 얻을 수 있는 chitosan의 김양식에 대한 처리효과를 조사하였다. 패각사상체 배양에 있어 패각에 chitosan을 처리하였을 때 처리하지 않은 패각에 비해 사상체의 부착이 현저히 높았다. 또한 30 cps, 90 cps chitosan을 처리한 후 비교하였을 때 30 cps chitosan 처리구의 사상체 부착율이 높은것으로 나타나 chitosan 종류에 따라 그 효과가 다름을 알 수 있었다. 이 결과는 채묘시 망에 chitosan 처리를 함으로써 망에 김 부착율을 높이고 결과적으로 다른 잡조류의 부착율을 떨어뜨릴 수 있다는 가능성을 보여주고 있다. 한편 실내 실험에서 엽체 배양에 chitosan을 처리한 결과 30 cps chitosan 처리구가 101.2%, 90 cps chitosan 처리구가 92.1%의 무게증가율을 보인 반면 control는 72.9%로 30 cps chitosan 처리구가 90 cps chitosan 처리구보다 9.1%, control 보다 28.3%의 증가율을 보였으며 90 cps chitosan 처리구도 comtrol 보다 19.2% 증가 하였으며 chitosan을 처리했을 때가 control 보다 훨씬 부드럽고 윤기가 좋았다. 이 결과는 김양식 중에 chitosan을 처리함으로써 수확량 증가와 품질개선효과도 볼 수 있다는 가능성을 보여주고 있다.
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