Abstract P2-05-24: OPG+ bone marrow B cells induced by non-metastatic tumors inhibit the pre-metastatic bone niche induced by T cells
0
Citation
0
Reference
10
Related Paper
Abstract:
Abstract Using the 4T1 model of experimental breast cancer we had recently shown that cancer induced bone disease starts before metastatic colonization and is mediated by RANKL expressed by tumor specific T cells. The role of anti-tumor B cell immune response in the context of cancer induced bone disease has never been investigated. There is evidence in the literature that B cells are good prognostic markers for metastatic breast cancer. B cells have an intimate relationship with bone cells as they differentiate from HSC present on endosteal surfaces; cross-talk with skeletal system through the RANK-RANKL-OPG signaling axis; and produce OPG, a decoy receptor of RANKL. Here we used the BALB/c derived 4T1 (metastatic) and 67NR (non-metastatic) sibling cell lines of mammary mouse carcinomas. By day 7, 14 and 21 after tumor injection, B220+ BM B cells from 67NR+ animals produce high amounts of OPG in vitro in contrast to B220+ BM B cells of 4T1+ mice. In vitro, BM B cells from 67NR+ mice, but not from 4T1+, could inhibit the RANKL dependent, anti-4T1 T cell mediated-OC differentiation ascertained by TRAP enzymatic activity, morphology and osteolytic disk assay. Transference of BM B cells from 67NR+ mice together with 4T1 tumor cells to BALB/c mice led to inhibition of osteoclastogenesis, increased numbers of bone lining cells and mesenchyme stem cell. Besides acting directly on the bone remodeling system, these B cells also modulated T cell activity evidenced by diminished RANKL and IL-17F production. All the anti-osteolytic and pro-osteogenic activity of B cells modulate and inhibits the pre-metastatic niche formation. Indeed transference of such cells to 4T1 animals inhibited LN and BM metastatic colonization. We conclude that 67NR induced OPG+ B cells can inhibit pro-osteoclastic / pre-metastatic activity of tumor induced T cells, favoring a bone metastasis free-phenotype. These findings have implications, not only for the understanding of the direct contribution of B cells in the control of bone metastasis but also it might be a promising prognostic tool for predicting cancer-induced bone metastasis. Citation Format: Bonomo A, Monteiro AC, Leal AC, Fontão AP, Spinetti E, Balduino A. OPG+ bone marrow B cells induced by non-metastatic tumors inhibit the pre-metastatic bone niche induced by T cells. [abstract]. In: Proceedings of the Thirty-Eighth Annual CTRC-AACR San Antonio Breast Cancer Symposium: 2015 Dec 8-12; San Antonio, TX. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2016;76(4 Suppl):Abstract nr P2-05-24.We have previously reported that microgravity promotes the activation of osteoclasts in cultured regenerating scales. This osteoclastic activation was induced by increased levels of receptor activator of the nuclear factor-κB ligand (RANKL). Therefore, we determined that RANKL is an important factor in evaluating osteoclastogenesis in bone tissue. However, the role of RANKL in fish scales is poorly understood. In the present study, we prepared antiserum against goldfish RANKL in rabbits and detected RANKL-producing cells in regenerating goldfish scales. Furthermore, we studied osteoclastic activation by the addition of RANKL to examine exogenous RANKL on osteoclastogenesis in regenerating goldfish scales. As a result, RANKL immune-positive cells were detected in grooves of regenerating scales. In addition, treating the regenerating scales with mammalian RANKL for 3 h significantly increased the expression of the nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic 1 (NFATc1), which is essential for osteoclast differentiation. After 6 h of incubation with RANKL, the expression of cathepsin K, a functional osteoclastic gene, significantly increased. Furthermore, the molecules for osteoclast multinucleation and differentiation significantly increased following treatment with mammalian RANKL. Therefore, in fish scales as well as mammalian bone, we concluded that RANKL plays an important role in osteoclastogenesis.
Cathepsin K
Cite
Citations (6)
RANK Ligand
Cite
Citations (11)
Cite
Citations (3)
Objective To investigate the effects of TNF-α on RANKL and OPG mRNA expressions in human synovial cells.MethodThe human synovial cells were treated with TNF-α of different concentrations and periods.The mRNA expressions of RANKL and OPG were analyzed by RT-PCR.Results TNF-α could up-regulate the mRNA expression of both RANKL and OPG, while the RANKL/OPG ratio were upgraded at 10 ng/mL TNF-α con-centration.Moreover, the RANKL/OPG ratio was elevated significantly above the control group(P 0.01) at 12 and 24 hours.Conclusion TNF-α may affect osteoclasia around articulus which has pathological changes by up-regu-lating the RANKL/OPG expression ratio of synovial cells.
Cite
Citations (0)
Objective To investigate the effect of 1α,25-dihy-droxyvitamin D3 (1α,25(OH)2D3) on the expression of receptor activator of NF-КB ligand (RANKL),osteoprotegerin (OPG) and RANKL mRNA,OPG mRNA,of rat osteobalsts (OB). Method The expression of RANKL and OPG was detected by the method of Immunohistochemistry and ELISA. RANKL mRNA and OPG mRNA were determined through FQ-PCR. Results Compared with the control group and the group with 1 nmol/L 1α,25(OH)2D3,10 and 100 nmol/L 1α,25(OH)2D3 can significantly induce the expression of RANKL and RANKL mRNA. 1,10 nmol/L 1α,25(OH)2D3 can stimulate the expression of OPG and OPG mRNA significantly,while 100 nmol/L 1α,25(OH)2D3 can inhibit the expression of OPG mRNA significantly. There were no difference in the rate of RANKL/OPG and RANKL mRNA/OPG mRNA between the control group and the group with 1 nmol/L 1α,25(OH)2D3,however the rate of RANKL/OPG and RANKL mRNA/OPG mRNA in the group with 10,100 nmol/L were higher than the control group and the group with 1 nmol/L 1α,25(OH)2D3. Conclusion Lower dosage of 1α,25(OH)2D3 (1 nmol/L) had no significant effect on bone turnover,but higher dosage of 1α,25(OH)2D3 (10,100 nmol/L) can enhance bone turnover through facilitating the formation and activity of osteoclasts via enhancing RANKL mRNA/OPG mRNA and RANKL/OPG..
Bone remodeling
Cite
Citations (0)
Abstract Osteocytes, known to have mechano-sensory functions, influence the regulation of bone remodeling. However, the mechanism by which osteocytes regulate bone metabolism when mechanical forces are being applied is still unclear. Osteoclastogenesis is mainly regulated by receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL); the protein osteoprotegerin (OPG) and angiogenesis also play important roles in osteogenesis. RANKL, OPG, and vascular endothelial growth factor (VEGF) are thought to be key factors for bone metabolism. In this study, we examined the effect of a continuous compressive force (CF) on the expression of RANKL, OPG, and VEGF in osteoblastic murine osteocytes (MLO-Y4) and osteoblastic (MC3T3-E1) cells. Gene and protein expression levels of RANKL, OPG, and VEGF in MLO-Y4 and MC3T3-E1 cells were quantitatively determined by real-time PCR and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Both cell types were also subjected to a CF of 1.0 g/cm 2 for 1, 3, 6, and 12 hours. Furthermore, the effect of a stretch-activated (S-A) channel was examined by gadolinium (Gd 3+ ) administration. The ratio of gene and protein expressions of RANKL, VEGF, and RANKL/OPG in MLO-Y4 cells were significantly higher than in MC3T3-E1 cells, while the expression of OPG was significantly lower. After CF application, both cell types showed significant increases in RANKL and VEGF expression as well as the RANKL/OPG ratio. Additionally, the upregulated gene and protein levels of these factors were reduced by Gd 3+ administration. These findings suggest that osteocytes play more important roles in bone metabolism and angiogenesis than osteoblasts. Osteocytes regulate the expression of RANKL, OPG, and VEGF via the S-A channel through the response to mechanical stress.
Bone remodeling
Cite
Citations (0)
Background: S-RANKL (Receptor activator of nuclear factor Кappa-B ligand) is a member of the TNF/TNF receptor superfamily. RANKL has been identified to control bone regeneration and remodeling. S-RANKL is secreted by osteoblasts and binds to the RANK receptor on osteoclast precursor and mature osteoclast cells. Variation in concentration levels of S-RANKL throughout several organs reconfirms the importance of RANKL in bone growth. S-RANKL is ability to stimulate osteoclast formation and activity.Methods: S-RANKL is estimated on 55 patients with Diffuse Idiopathic Skeletal Hyperostosis (DISH), 25 patients with Ankylosing Spondilitis (AS), 50 patients with spondylosis and 15 particularly healthy people aged 55-65. All patients were treated and monitored in University Clinic of Rheumatology, UMHAT “Sveti Georgi”, Plovdiv, Bulgaria. The measuring of the S-RANKL is done by ЕLISA-method with reader (Sitio-Microplate reader, Seac, Itаlу), ƛ 450 nm, with a kits of eBioscience, Austria. The statistic processing is done with SPSS 23 programme (p<0.01).Results:The average measurements of s-RANKL of patients with DISH were 197,00±35,90 pg/ml, in patients with AS 190,86±18,54 pg/ml. S-RANKL in patients with spondilosis were 20,60±66,16 pg/ml, and in old control group were 23,33±15,07 pg/ml. The average measurements of s-RANKL in patients with DISH and AS were significant higher in comparison with the results of patients with spondylosis and healthy people, regardless of their age (p<0.05).Conclusion: S-RANKL is significantly increased in patients with DISH and spondylosis in comparison with the results of patients with AS and healthy old people. Hypothetically, this might be a result as a sequence of events, based on stimulation of inflammatory proteins, on-going osteoporosis and compresion fractures in patients with DISH and spondylitis. The endurance of the vertebrae is decreased and the body increases the production of proteins from the osteoblasts to form compensatory more bone substance. The overproduction of S-RANKL is implicated in new bones formation in patients with DISH. Blocked up at S-RANK might have an important role in the suppression of pathological processes in this diseases. The results indicate a possible common pathogenic connection between inflammatory joint disease (AS) and degenerative joint disease(DISH).
RANK Ligand
Bone remodeling
Cite
Citations (0)
Exposure to microgravity during space flight has caused astronauts to experience decreased bone density, resulting from bone resorption by osteoclastic activation. Activation of the nuclear factor-κB ligand (RANKL) of the RANKL-producing cells, a known osteoclastogenesis-promoting factor, seems to be induced under microgravity. However, the role of the RANKL-producing cells under microgravity has not yet been demonstrated due to the lack of suitable in vitro organ culture of osteoblasts, osteoclasts, and osteocytes with the intact bone matrix under microgravity. Previous reports demonstrated that RANKL-producing cells were detected with a specific antiserum for goldfish RANKL in the regenerating goldfish scales. In this study, the response of RANKL-producing cells to simulated microgravity with a three-dimensional clinostat was examined using in vitro organ culture system with regenerating scales. In addition, mRNA expression analysis of osteoclastic and osteoblastic markers via quantitative real-time PCR was conducted together with histological analysis of RANKL-producing cells. After 4 days of exposure to simulated microgravity, the number of RANKL immune-positive cells increased compared with the RANKL immune-positive cells in control regenerating scales. The Rankl mRNA expression in the regenerating scales after simulated microgravity treatments was significantly higher than that in the control (1G) scales. The mRNA expression of osteoprotegerin (Opg), an osteoclastogenesis inhibitory factor, significantly decreased under simulated microgravity conditions. The ratio of Rankl/Opg in the simulated microgravity-treated scales was significantly higher than that in the scales of 1G control. The change in the ratio of Rankl/Opg implied that osteoclastic activation is promoted after simulated microgravity treatments. Actually, in the regenerating scales exposed to simulated microgravity, the mRNA expression of osteoclastic markers, such as receptor activator of NFκB, cathepsin K, integrin beta-3, and cellular-Src, significantly increased. On the other hand, the mRNA expression of the osteoblastic markers (collagen type I alpha 1 and osteocalcin) significantly decreased. The changes in the osteoclastic and osteoblastic markers were consistent with our previously reported experiment on the International Space Station. To the best of our knowledge, we are the first to demonstrate the activation of RANKL-producing cells under simulated microgravity conditions by in vitro organ culture using regenerating goldfish scales. We strongly emphasize that fish scales serve as an excellent bone model for the analysis of gravitational responses while maintaining conditions similar to in vivo.
Clinostat
Weightlessness
Cite
Citations (2)
Η οστική ανακατασκευή είναι μια συνεχής διαδικασία ανανέωσης των μικρομονάδωντων οστών με διαδοχική ενεργοποίηση και λειτουργία των οστεοκλαστών καιοστεοβλαστών, κυττάρων υπεύθυνων για την οστική απορρόφηση και παραγωγή,αντίστοιχα. Φυσιολογικά και οι δύο διεργασίες βρίσκονται σε δυναμική ισορροπίαμεταξύ τους, εξασφαλίζοντας την σκελετική ακεραιότητα. Η διατάραξη αυτής τηςισορροπίας αποτελεί την κύρια αιτία πρόκλησης σκελετικών νοσημάτων, όπως ηοστεοπόρωση. Η κυτταροκίνη RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor κΒLigand) μέλος της υπεροικογένειας του TNF (Tumor Necrosis Factor), αποτελεί τονκύριο διαμεσολαβητή στην διαδικασία της οστικής απορρόφησης καθώς επάγει τηνδιαφοροποίηση, επιβίωση και ενεργοποίηση των οστεοκλαστών. Ως τριμερέςσυνδέεται στον υποδοχέα του RANK, επάγοντας τον τριμερισμό του και τηνενεργοποίηση των ενδοκυτταρικών μονοπατιών που οδηγούν στην δημιουργίαώριμων και λειτουργικών οστεοκλαστών, ενώ η δράση του RANKL αναστέλλεταιαπό την οστεοπροτεγερίνη (OPG), ένα ανταγωνιστικό διαλυτό υποδοχέα. Η αναλογίαμεταξύ RANKL και OPG καθορίζει τη βιοδιαθεσιμότητα και τη δράση του RANKLστα βιολογικά συστήματα. Η σημασία του RANKL στην βιολογία του σκελετικούσυστήματος φαίνεται από το γεγονός ότι μεταλλάξεις στο γονίδιο του RANKL προκαλούν αυτοσωμική υπολειπόμενη οστεοπέτρωση λόγω αδυναμίας σχηματισμούοστεοκλαστών. Αντιθέτως, αυξημένη παραγωγή του RANKL συνδέεται με επαγωγήοστεοκλαστικής δραστηριότητας και οστικής απώλειας σε ασθένειες όπως ηοστεοπόρωση, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, το πολλαπλό μυέλωμα, οι οστικέςμεταστάσεις και οι περιοδοντικές ασθένειες. Η αναστολή της δράσης του RANKLθεωρείται μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση για την παρεμπόδιση τηςοστικής απώλειας στις παραπάνω ασθένειες και έχει ήδη εγκριθεί η χορήγηση ενόςμονοκλωνικού αντισώματος, του denosumab, έναντι του RANKL σεεμμηνοπαυσιακές οστεοπορωτικές γυναίκες. Το γεγονός αυτό καθιστά αναγκαία τηνεύρεση νέων αναστολέων του RANKL και την αξιολόγησή τους σε κατάλληλα ζωικάμοντέλα.Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκαν δύο μοναδικά ζωικάμοντέλα που έχουν δημιουργηθεί από την ερευνητική ομάδα της Επίκ. ΚαθηγήτριαςΕλένης Ντούνη. Το πρώτο γενετικό μοντέλο χαρακτηρίζεται από αυτοσωμικήυπολειπόμενη οστεοπέτρωση και οφείλεται σε μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιοRANKL του ποντικού που προκαλεί αντικατάσταση ενός αμινοξέος από γλυκίνη σε αργινίνη στην θέση 278, (G278R), καθιστώντας ανενεργή την πρωτεΐνη RANKL. Η μελέτη της υπεύθυνης μετάλλαξης έχει οδηγήσει στην κατανόηση του μοριακούπαθογενετικού μηχανισμού και στον σχεδιασμό νέων αναστολέων έναντι τουRANKL. Πιο συγκεκριμένα δείξαμε με πειράματα ανοσοαποτύπωσης και crosslinkingότι η μεταλλαγμένη RANKLG278R πρωτεΐνη δεν σχηματίζει ομοτριμερή καιέχει απολέσει την βιολογική της δραστικότητα. Ακόμη σε ex vivo κυτταρικές δοκιμέςδείξαμε ότι η RANKLG278R δεν επάγει τον σχηματισμό οστεοκλαστών ενώ ασκείκυρίαρχη αρνητική επίδραση στην δράση της άγριου τύπου RANKL. Λ όγω τ ηςυψηλής συντηρητικότητας που εμφανίζει η γλυκίνη στην θέση 278 μεταξύ των μελώντης υπεροικογένειας του TNF, προχωρήσαμε σε βιοχημικό και λειτουργικόχαρακτηρισμό των πρωτεϊνών TNF και BAFF του ανθρώπου εισάγοντας τηναντίστοιχη αμινοξική αλλαγή από γλυκίνη σε αργινίνη. Ομοίως, δείξαμε ότι οιμεταλλαγμένες TNFG122R και BAFFG249R πρωτεΐνες δεν σχηματίζουν τριμερή και δενείναι βιολογικά ενεργές. Η αναγνώριση ενός τόσο κρίσιμου αμινοξέος πουσυμμετέχει ενεργά στον τριμερισμό των πρωτεϊνών της TNF υπεροικογένειαςαποτελεί δυνητικά ένα σημαντικό φαρμακευτικό στόχο στην λογική σχεδιασμού νέωνφαρμάκων για την αναστολή του τριμερισμού. Το μικρό μόριο SPD-304 έχει χαρακτηριστεί ως ένας αναστολέας του τριμερισμού του TNF ωστόσο ηδραστικότητά του έναντι του RANKL δεν ήταν γνωστή. Δείξαμε ότι το SPD-304αλληλεπιδρά με την RANKL πρωτεΐνη προκαλώντας αναστολή σε δοκιμέςοστεοκλαστογένεσης. Όμως η υψηλή τοξικότητα του SPD-304 το καθιστάακατάλληλο για φαρμακευτική χρήση. Έτσι, σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν συνολικά72 ενώσεις ανάλογα του SPD-304 από τις οποίες ταυτοποιήσαμε 7 ενώσεις με τα εξήςχαρακτηριστικά: 1) αποτελούν ισχυροί αναστολείς σε δοκιμές οστεοκλαστογένεσης,2) παρουσιάζουν σημαντικά μικρότερη κυτταροτοξικότητα σε σχέση με το SPD304,και 3) παρουσιάζουν μεγάλη εξειδίκευση με την πρωτεΐνη-στόχο RANKL. Επίσης,βιοχημικός έλεγχος έδειξε ότι τα SPD-304 ανάλογα αποδιατάσσουν το τριμερές τουRANKL. Επόμενος στόχος είναι η αξιολόγηση αυτών των αναστολέων του RANKLσε προκλινικό επίπεδο με τη χρήση κατάλληλων ζωικών μοντέλων οστεοπόρωσης.Πάνω σε αυτή την λογική, προχωρήσαμε στην δημιουργία και χαρακτηρισμό ενόςκαινοτόμου γενετικού μοντέλου οστεοπόρωσης με την υπερέκφραση του RANKLτου ανθρώπου σε διαγονιδιακά ποντίκια. Χαρακτηρίσαμε 2 διαγονιδιακές σειρές, την Tg5516 που φέρει ένα αντίγραφο του διαγονίδιου και την Tg5519 με δέκα επιπλέοναντίγραφα. Ποσοτική ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του διαγονιδίου huRANKLέδειξε έκφραση στην Tg5516 σειρά και ακόμη υψηλότερα επίπεδα στην Tg5519σειρά κυρίως σε οστά, σπλήνα και εγκέφαλο. Επίσης, η υπερέκφραση του huRANKL στις δύο διαγονιδιακές σειρές ακολουθεί το ίδιο πρότυπο έκφρασης με το ενδογενέςγονίδιο (muRANKL). Ο φαινοτυπικός χαρακτηρισμός έδειξε ότι η Tg5516 σειράαποτελεί ένα μοντέλο ήπιας οστεοπόρωσης με οστική απώλεια του σπογγώδουςοστού, ενώ η Tg5519 σειρά εμφανίζει έντονη οστεοπόρωση με κύρια χαρακτηριστικάτην πλήρη απώλεια του σπογγώδους οστού, πορώδη δομή στο φλοιώδες οστό,αυξημένη οστεοκλαστογένεση, σταδιακή καταστροφή της αυξητικής πλάκας καιαυξημένη λιπογένεση στο μυελό των οστών. Τέλος, με την θεραπεία τηςοστεοπόρωσης στα Tg5519 ποντίκια έπειτα από χορήγηση του αντισώματοςdenosumab, διαπιστώσαμε ότι τα TgRANKL ποντίκια αποτελούν κατάλληλα μοντέλαοστεοπόρωσης για την αξιολόγηση νέων φαρμάκων, όπως των SPD-304 αναλόγων,σε προκλινικό επίπεδο.
Denosumab
RANK Ligand
Cite
Citations (0)
Proinflammatory cytokine
RANK Ligand
Cite
Citations (95)