Komplementationsstudien der cpd-Mutante und Analyse der CPD-Interaktionspartner mittels reverser Genetik
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Abstract:
Anhand von Komplementationsstudien der cpd-Mutante konnte die Funktionalitaet eines CPD-GFP-Fusionsproteins in planta demonstriert werden. Die Komplementation erfolgte unter Kontrolle des endogenen CPD-Promotors und unter Kontrolle des konstitutiven CaMV-35S-Promotors. Die transgenen Pflanzen wurden zur zellulaeren und gewebespezifischen Lokalisation des CPD-Proteins verwendet. Die Lokalisation des CPD-Proteins an der ER-Membran konnte sowohl ueber die Detektion der GFP-Fluoreszenz des generierten CPD-Fusionsproteins als auch mit einer Westen-Blot-Analyse eines differentiell zentrifugierten Zellextrakts bestaetigt werden. Konditionale Komplementationsstudien der cpd-Mutante verdeutlichen die wichtige Rolle von Brassinosteroiden bei der Pflanzenentwicklung. Durch konditionale, biochemische Komplementationen wurde demonstriert, das Brassinosteroide kontinuierlich waehrend der Pflanzenentwicklung benoetigt werden. Durch die konditionale genetische Komplementation der cpd-Mutante mit einem Oestradiol-induzierbaren Komplementationskonstrukt und der Verwendung eines unabhaengigen, induzierbaren GUS-Reporterkonstruktes war es moeglich einen Steroidtransport in planta nachzuweisen. Anhand des induziebaren GUS-Konstruktes wurde die inhomogene Oestradiol-Verteilung nach der lokal begrenzten Applikation mit Oestradiol-haltiger Lanolinpaste gezeigt. Verschiedene Studien belegen den Transport des Oestradiols. Die entsprechende lokale Komplementation der cpd-Mutante hat eine ganzheitliche Reaktion der Pflanze gezeigt, was einen Transport des Syntheseendprodukts Brassinolid oder eines nachgeschalteten Signals belegt. Die Analyse der CPD-Interaktionspartner ueber reverse Genetik hat zur Identifikation der iap2-1-Mutante gefuehrt, die eine T-DNA-Insertion in einem, fuer ein Ringfingerprotein-codierendes Gen traegt. Die Mutante weist einen vergleichbaren Phaenotyp wie CPD-Ueberexpressionslinien auf, die auf Kontrollmedium ein verstaerktes Wurzelwachstum entwickeln. Die iap2-1-Mutante zeigt auf Hochsteroidmedium eine hypersensitive Reaktion gegenueber Brassinolid, was auf einen veraenderten, endogenen Steroidgehalt oder eine modulierte Signaltransduktion hindeutet. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der postulierten Funktion des IAP2-Ringfingerproteins, das als E3-Ubiquitin-Ligase an der Regulation der CPD-Proteinstabilitaet beteiligt sein kann. Es bleibt aber offen, ob IAP2 an der direkten Regulation des CPD-Proteins oder einer anderen Komponente der Brassinosteroidsignaltransduktion beteiligt ist. Die Analyse von T-DNA-Insertionsmutanten in fuenf OBP-Genen hat nicht zur Identifikation eines Steroidphaenotyps gefuehrt. Damit zeichnet sich eine redundante Funktionalitaet innerhalb der OBP-Proteinfamilie aus A. thaliana ab, wie sie z. B. bei den homologen OSH-Proteinen in Hefe beobachtet wurde ab. Analysen von Doppel- und Mehrfachmutanten der CPD-Interaktionspartner und insbesondere der obp-Mutanten werden ein genaueres Bild der IAP und OBP-Funktion geben.Cite