Development of sheep kidney cells with increased resistance to different subgenotypes of BVDV-1 by RNA interference
6
Citation
32
Reference
10
Related Paper
Citation Trend
Functional Genomics
RNA Silencing
Cite
Citations (31)
Cite
Citations (590)
RNA 干扰(RNAi ) 是在多重有机体的基因 silencing 的 evolutionarily 保存的进程，它为由反向的遗传调查基因功能成为了一个强大的工具。最近，许多组报导了使用综合 oligonucleotides 或 siRNA 编码原生质标志由 transfection 在哺乳动物的房间导致 RNAi，但是这仍然在它的申请被限制，特别当产生长期的基因 silencing 体内是必要的时。避免这个问题，交付 retrovirus 或交付 lentivirus 的 RNAi 被开发了。这里，我们描述了为交付短发卡 RNA (shRNA ) 的病毒的系统从 H1 倡导者抄录了的二枚制动火箭。结果证明病毒的调停向量的 RNAi 能实质地击倒的制动火箭在 293-T 房间调整人的 p53 的表示。而且，制动火箭在我们的转导系统的病毒的调停向量的 RNAi 能稳定地很长时间使 p53 基因失去活性。比作从 U6 倡导者，抄录的 shRNAs 驾驶 H1 的 shRNA 戏剧性地也减少了 p53 的表示。驾驶 H1 、驾驶 U6 的 shRNAs 的 p53 down 规定效率是几乎相同的。结果显示病毒的交付向量的 RNAi 将是的那枚制动火箭在功能的基因组学和基因治疗的一个有用工具。
RNA Silencing
RNA-induced transcriptional silencing
Trans-acting siRNA
Cite
Citations (0)
RNA Silencing
Transduction (biophysics)
Trans-acting siRNA
Cite
Citations (10)
The discovery that small interfering RNA duplexes (siRNA) can silence gene expression in mammalian cells has revolutionized biomedical research. The most successful application of the discovery has been to study gene function in cultured human or mouse cells. However, the knockdown effect of siRNA is only transient. To achieve a more sustained gene-silencing effect, shRNA (small hairpin RNA) expressed from a vector is preferred. An additional benefit of shRNA is that RNA interference (RNAi) can now be applied in vivo through delivering shRNA-expressing vectors by transgenic technology. Transgenic RNAi not only allows the study of biological processes not present in cultured cells but also offers chronic therapeutic potentials. In this review, we will summarize the developments in the generation of transgenic RNAi mice.
RNA Silencing
Cite
Citations (37)
Η β-μεσογειακή αναιμία (β-ΜΑ) αποτελεί μια από τις συχνότερες μονογονιδιακές νόσους με εκτιμώμενο αριθμό 80 εκατομμυρίων φορέων παγκοσμίως. Σήμερα, βασική θεραπευτική αγωγή αποτελεί η δια βίου, τακτική μετάγγιση αίματος, με συγχορήγηση σιδηροδεσμευτικών χηλικών ουσιών. Στο οπλοστάσιο των εναλλακτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων συγκαταλέγονται η αλλογενής μεταμόσχευση μυελού των οστών από ιστοσυμβατούς δότες, αλλά και η αυτόλογη μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (ΑΑΚ) μετά από γενετική διόρθωση, στα πλαίσια των προσεγγίσεων γονιδιακής θεραπείας. Η παρούσα μελέτη αποτελεί μια εναλλακτική προσέγγιση στη γονιδιακή θεραπεία της β-θαλασσαιμίας, που στοχεύει στη μείωση της παθολογικής περίσσειας των αλυσίδων της α-σφαιρίνης. Η ελαττωμένη παραγωγή β-σφαιρίνης, σε συνδυασμό με τη φυσιολογική σύνθεση της α-σφαιρίνης, οδηγεί στην ποσοτική περίσσεια των α-αλυσίδων και ακολούθως στην κατακρήμνιση τους, με αποτέλεσμα την απόπτωση και την πρόωρη καταστροφή των πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού των οστών [μη αποδοτική ερυθροποίηση). Η σημασία της διερεύνησης της α-σφαιρίνης ως θεραπευτικού στόχου έχει επιβεβαιωθεί και από περιπτώσεις ασθενών με διπλή ετεροζυγωτία για την α- και τη β-θαλασσαιμία στους οποίους έχει παρατηρηθεί βελτίωση του κλινικού φαινοτύπου. Η ανάπτυξη μιας εναλλακτικής προσέγγισης στη γονιδιακή στόχευση της β-μεσογειακής αναιμίας στηρίχτηκε στο μηχανισμό της παρεμβολής του RNA (RNA interference, RNAi), που αφορά στη διαδικασία της εξειδικευμένης μεταμεταγραφικής αποσιώπησης συγκεκριμένης ακολουθίας μορίων mRNA. Η αξιοποίηση της τεχνολογίας του RNAi αποτελεί πλέον σημαντικό εργαλείο, τόσο για τη βασική έρευνα, όσο και τη ρύθμιση κλινικά σημαντικών γονιδίων. Θεωρητικά, κάθε ασθένεια που προκαλείται από την ενεργοποίηση ενός ή περισσοτέρων γονιδίων μπορεί να αντιμετωπιστεί με τη μέθοδο του RNAi, ενώ θεραπευτικές εφαρμογές ήδη βρίσκονται στο στάδιο των κλινικών δοκιμών. Η επαγωγή μιας θεραπευτικά σημαντικής μείωσης της α-σφαιρίνης στη β-μεσογειακή αναιμία, απαιτεί τη σταθερή αποσιώπηση της στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα των ασθενών. Μόνη επιλογή για την επίτευξη σταθερής γονιδιακής αποσιώπησης αποτελεί η έκφραση των μορίων siRNA από ιϊκούς φορείς, ικανούς να ενσωματώνονται σταθερά στο γονιδίωμα των κυττάρων-στόχων. Οι φορείς επιλογής στην παρούσα εργασία είναι οι φορείς από αφροϊούς (FV-foamy viruses), οι οποίοι ανήκουν στην υποοικογένεια Spumaretrovirinae των ρετροϊών, με σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι των υπολοίπων ιϊκών φορέων. Φυσικοί φορείς των αφροϊών είναι τα πιθηκοειδή, στα οποία δεν έχουν ενοχοποιηθεί για κάποιο νόσημα, Στα πλεονεκτήματα των αφροϊικών φορέων περιλαμβάνονται ο εξαιρετικά ευρύς κυτταρικός τροπισμός, ένα ευνοϊκό πρότυπο ενσωμάτωσης μακριά από κώδικές αλληλουχίες, η ικανότητα παραμονής σε μη-διαιρούμενα κύτταρα (φάση G0) και η αποτελεσματική διαμόλυνση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Οι ιδιότητες αυτές τους καθιστούν ιδιαίτερα υποσχόμενη τεχνολογία σε σχέση με τους γ-ρετροϊούς και τους λεντοϊούς, ειδικά από άποψη κλινικής ασφάλειας. Ο βασικός πειραματικός όγκος της παρούσας διατριβής επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη και αξιολόγηση νέων αφροϊικών φορέων-RNAi, ικανών να επάγουν σταθερή γονιδιακή αποσιώπηση, με τελικό στόχο την εφαρμογή τους στη μείωση της α-σφαιρίνης στη β-μεσογειακή αναιμία. Χρησιμοποιώντας απενεργοποιημένους αφροϊικούς φορείς τρίτης γενιάς (ΔΦ) που εκφράζουν μόρια shRNA υπό τον έλεγχο των υποκινητών της RNA Pol III (mU6 του ποντικού και Η1 του ανθρώπου) μελετήθηκε λεπτομερώς η εφαρμογή των φορέων FV στην επαγωγή του μηχανισμού RNAi. Μέσω μια σειράς πιλοτικών πειραμάτων για τη μελέτη της αποσιώπησης του γονιδίου-μάρτυρα GFP σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές in vitro, αλλά και σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα ex vivo και in vivo, δείχτηκε ότι και οι δύο τύποι υποκινητών επάγουν υψηλά επίπεδα αποσιώπησης με πτώση της έκφρασης της GFP έως το 60% της αρχικής τιμής, ακόμα και με ένα ενσωματωμένο αντίγραφο φορέα (ΜOI<1). Παρόλα αυτά, η σταθερή έκφραση μορίων shRNA από τους φορείς με τον υποκινητή mU6 ήταν τοξική στις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν, οδηγώντας σε προοδευτική απόπτωση των διαμολυσμένων κυττάρων. Αντίθετα, οι φορείς με τον υποκινητή Η1, ήταν αποτελεσματικοί και σταθεροί in vitro, υποδεικνύοντας τη σημασία της συνολικής κυτταρικής φυσιολογίας στην εκτίμηση των παρατηρούμενων επιδράσεων. Η αποτελεσματικότητα των φορέων Η1 ήταν σταθερή και στην αποσιώπηση του ογκογονιδίου BCR-ABL στην λευχαιμική σειρά Κ562, ενισχύοντας τη δυνατότητα εφαρμογής των αφροϊικών φορέων-RNAi στην κατευθυνόμενη θεραπεία νεοπλασματικών διαταραχών, όπως η χρόνια μυελογενής λευχαιμία. Σε αντίθεση με τα ανθρώπινα κύτταρα, οι φορείς mU6 ήταν ικανοί για αποτελεσματική και σταθερή αποσιώπηση στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα του ποντικού, τόσο ex vivo, όσο και in vivo. Σε μοντέλο μεταμόσχευσης μυελού των οστών, η ελάττωση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου στα μεταμοσχευμένα ζώα έφτασε το 70- 90%, έως και 3 μήνες μετά τη μεταμόσχευση. Η τεχνογνωσία που αποκτήθηκε, εφαρμόστηκε στη στόχευση της περίσσειας των α-αλυσίδων στη β-μεσογειακή αναιμία, μελετώντας έναν αριθμό διαφορετικών μορίων shRNA κατά της α-σφαιρίνης του ανθρώπου και του ποντικού. Η αρχική επιλογή των αποτελεσματικότερων αλληλουχιών shRNA έγινε in vitro, στις ερυθρολευχαιμικές σειρές MEL του ποντικού και Κ562 του ανθρώπου. Τρεις, τουλάχιστον, αλληλουχίες μορίων shRNA για κάθε είδος, ήταν ικανές να επάγουν σταθερή μείωση του mRNA της α-σφαιρίνης του ποντικού (10-20%) και του ανθρώπου (έως και 50%) ακόμα και σε χαμηλό MOI (1-5), που ήταν ανιχνεύσιμη και σε επίπεδο πρωτεΐνης. Τα αποτελέσματα στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα ήταν ακόμα πιο ενθαρρυντικά. Όλα τα υποψήφια μόρια shRNA μείωσαν αποτελεσματικά την έκφραση της α-σφαιρίνης κατά 70-85% στο ποντίκι και 50-95% στον άνθρωπο. Σε λειτουργικό επίπεδο, παρατηρήθηκε ότι η μείωση της α-σφαιρίνης σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα φυσιολογικών ατόμων επάγει μια φαινοτυπική κατάσταση «α-θαλασσαιμίας», που συνοδεύεται από την αυξημένη ερυθροποίηση που παρατηρείται στα θαλασσαιμικά σύνδρομα. Ανάλογες λειτουργικές μελέτες στο θαλασσαιμικό μοντέλο ποντικού th3/+, έδειξαν ότι η ελάττωση της περίσσειας της α-σφαιρίνης κατά 40-50% επιφέρει μια γενικότερη αποκατάσταση της φυσιολογικής διαδικασίας ερυθροποίησης, όπως τεκμηριώθηκε με τη διόρθωση της κλωνογόνου ικανότητας των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (αριθμός αποικιών BFUe) και τη μεταβολή των δεικτών ερυθροποίησης (CD71/Terll9). Η παρούσα μελέτη περιλαμβάνει, για πρώτη φορά, τη λεπτομερή ανάλυση του συστήματος των αφροϊικών φορέων στην επαγωγή του μηχανισμού RNAi, παρέχοντας σημαντικές πληροφορίες για τους περιορισμούς και την αποτελεσματικότητα της τεχνολογίας. Επιπλέον, εξετάζει αναλυτικά τα ποσοτικά χαρακτηριστικά της μείωσης της α-σφαιρίνης, σε διαφορετικά κυτταρικά συστήματα του ανθρώπου και του ποντικού και τις επακόλουθες λειτουργικές επιδράσεις στην πορεία της ερυθροποίησης. Τα αποτελέσματα της μελέτης υποδεικνύουν ότι η αποσιώπηση της α-σφαιρίνης, τουλάχιστον ex vivo, επάγει μια γενικότερη λειτουργική κατάσταση «α-θαλασσαιμίας», η οποία μπορεί να δράσει εξισορροπητικά στην ποσοτική περίσσεια των α-αλυσίδων στη β-μεσογειακή αναιμία, επάγοντας τη βελτίωση του θαλασσαιμικού φαινοτύπου. Η παρούσα εργασία αποδεικνύει τόσο τη θεραπευτική χρησιμότητα του συστήματος των φορέων από αφροϊούς για RNAi, όσο και την αξία της α-σφαιρίνης στη στοχευμένη γονιδιακή θεραπεία της β-μεσογειακής αναιμίας.
Ex vivo
Cite
Citations (0)
The discovery that gene expression can be regulated using small RNAs that are complementary to messenger RNAs – a process known as RNA interference (RNAi) – has markedly advanced the understanding of eukaryotic gene regulation and function. Notably, just one decade since its discovery, RNAi is already being tested in clinical trials and is set to revolutionize the treatment of disease. In recent years, much progress has been in improving the efficiency and widening the possibilities of RNAi. Lentiviral-mediated delivery of RNAi represents a major advance in the field. Despite the transfection of chemically synthesized small RNAs, lentiviral-mediated gene silencing can be applied not only to regular cell lines, but also to primary and nondividing cells. Furthermore, the transduced vectors can contain markers for selection, allowing the generation of stable cell lines, and also of cassettes to obtain a regulated shRNA expression. The protocol in this chapter describes the steps leading to the production of lentiviral vectors, and to infection of the desired recipient cells.
RNA Silencing
Cite
Citations (1)
RNA Silencing
Cite
Citations (1)
RNA interference (RNAi) induced by small interfering (siRNA) or short hairpin RNA (shRNA) is an important research approach in mammalian genetics. Here we describe a technology called enzymatic production of RNAi library (EPRIL) by which cDNAs are converted by a sequence of enzymatic treatments into an RNAi library consisting of a vast array of different shRNA expression constructs. We applied EPRIL to a single cDNA source and prepared an RNAi library consisting of shRNA constructs with various RNAi efficiencies. High-throughput screening allowed us to rapidly identify the best shRNA constructs from the library. We also describe a new selection scheme using the thymidine kinase gene for obtaining efficient shRNA constructs. Furthermore, we show that EPRIL can be applied to constructing an RNAi library from a cDNA library, providing a basis for future whole-genome phenotypic screening of genes. PMID: 14704669
Cite
Citations (0)
Over the past decade, RNA interference (RNAi) plays an important role in biology, especially for silencing gene expression. RNA interference (RNAi) is a natural process through which expression of a targeted gene can be knocked down with high specificity and selectivity. Methods of mediating the RNAi effect involve small interfering RNA (siRNA) and short hairpin RNA (shRNA). In various applications, RNAi has been used to create model systems, to identify novel molecular targets, to study gene function in a genome-wide fashion, and to create new avenues for clinical therapeutics. This article reviews the current knowledge on the mechanism and applications of shRNA in mammalian and human cells. Keyword: shRNA, siRNA, RNAi, dicer, gene silencing
Dicer
RNA Silencing
Trans-acting siRNA
Cite
Citations (2)