A Chemical Genetic Screen in Zebrafish for Pathways Interacting withcdx4in Primitive Hematopoiesis
35
Citation
36
Reference
10
Related Paper
Citation Trend
Abstract:
cdx4, a caudal-related homeodomain-containing transcription factor, functions as a regulator of hox genes, thereby playing a critical role in anterior-posterior (A-P) patterning during embryogenesis. In zebrafish, homozygous deletion of the cdx4 gene results in a mutant phenotype known as kugelig, with aberrant A-P patterning and severe anemia characterized by decreased gata1 expression in the posterior lateral mesoderm. To identify pathways that interact with cdx4 during primitive hematopoiesis, we conducted a chemical genetic screen in the cdx4 mutant background for compounds that increase gata1 expression in cdx4 mutants. Among 2640 compounds that were tested, we discovered two compounds that rescued gata1 expression in the cdx4-mutant embryos. The strongest rescue was observed with bergapten, a psoralen compound found in bergamont oil. Another member of the psoralen family, 8-methoxypsoralen, was also found to rescue gata1 expression in cdx4-mutant embryos. The psoralen compounds also disrupted normal A-P patterning of embryos. These compounds modify the cdx4-mutant phenotype and will help elucidate signaling pathways that act downstream or parallel to the cdx4-hox pathway.Το zebrafish (Danio rerio) έχει εισαχθεί τα τελευταία χρόνια στην έρευνα του καρδιαγγειακού συστήματος και εμφανίζει μια σειρά από πλεονεκτήματα. Συγκεκριμένα, το γονιδίωμά του εμφανίζει υψηλή ομολογία με το ανθρώπινο, έχει σχετικά απλή καρδιακή ανατομία (δίχωρη καρδιά) και ενδοκαρδιακή κυκλοφορία, ενώ τα έμβρυα που λαμβάνονται είναι διάφανα, γεγονός που επιτρέπει τη μη επεμβατική παρακολούθηση της ανάπτυξης του καρδιαγγειακού συστήματος με μικροσκοπία. Επιπροσθέτως, ο μυοκαρδιακός ιστός εμφανίζει εκτεταμένη αναγεννητική ικανότητα, ακόμα και σε ενήλικα στάδια, ενώ παράλληλα έχει αναπτυχθεί μία πληθώρα γενετικών εργαλείων από ερευνητικές ομάδες που το χρησιμοποιούν ως μοντέλο στις μελέτες τους. Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της δυνατότητας αναγέννησης των καρδιακών βαλβίδων σε εμβρυικά και ενήλικα διαγονιδιακά μοντέλα zebrafish. Τα μοντέλα αυτά εκφράζουν τη βακτηριακή νιτρορεδουκτάση μέσω του συστήματος Gal4/UAS στις καρδιακές βαλβίδες. Με τη βοήθεια του προφαρμάκου μετρονιδαζόλη επιτυγχάνεται απώλεια των ενδοθηλιακών και μεσεγχυματικών βαλβιδικών κυττάρων. Σε έμβρυα που εκπλύθηκαν από τη μετρονιδαζόλη παρατηρήθηκε, μετά από 8 ημέρες, αναγέννηση της κολποκοιλιακής και αρτηριακής βαλβίδας. Αντίστοιχα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και σε πειράματα αναγέννησης ενήλικων καρδιών διαγονιδιακών ατόμων Gal4/UAS (εντός 15 ημερών). Η όλη διαδικασία φαίνεται να εμπίπτει σε ρύθμιση από το μοριακό μονοπάτι Notch, αφού χημική αναστολή του έδειξε μειωμένη αναγεννητική ικανότητα. Επιπροσθέτως, το zebrafish, λόγω του μεγάλου αριθμού διάφανων εμβρύων που μπορούν να ληφθούν μέσω εξωτερικής γονιμοποίησης, χρησιμεύει ως ένα ιδανικό πειραματικό μοντέλο σε ευρείας κλίμακας in vivo μελέτες χημικού γενετικού ελέγχου. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, αναπτύσσεται ένα παράδειγμα ταυτοποίησης νέων χημικών μορίων - αναστολέων της αγγειογένεσης με in vivo φαινοτυπική ανάλυση διαγονιδιακών εμβρύων zebrafish. Τα νέα αυτά μόρια αποτελούν ανάλογα του θειοφαινίου, με στόχο τη βελτιστοποίηση της αντιαγγειογενετικής δράσης μέσω του VEGFR2 σηματοδοτικού μονοπατιού.
Danio
Cite
Citations (0)
Cite
Citations (6)
Vertebrates use adaptive mechanisms when exposed to physiologic stresses. However, the mechanisms of pigmentation regulation in response to physiologic stresses largely remain unclear. To address this issue, we developed a novel pigmentation model in adult zebrafish using coldwater exposure (cold zebrafish). When zebrafish were maintained at 17 °C, the pigmentation of their pigment stripes was reduced compared with zebrafish at 26.5 °C (normal zebrafish). In cold zebrafish, gene expression levels of tyrosinase and dopachrome tautomerase, which encode enzymes involved in melanogenesis, were down-regulated, suggesting that either down-regulation of melanin synthesis occurred or the number of melanophores decreased. Both regular and electron microscopic observation of zebrafish skin showed that the number of melanophores decreased, whereas aggregation of melanosomes was not changed in cold zebrafish compared with normal zebrafish. Taken together, we here show that cold exposure down-regulated adult zebrafish pigmentation through decreasing the number of melanophores and propose that the cold zebrafish model is a powerful tool for pigmentation research.
Melanosome
Melanophore
Morpholino
Cite
Citations (14)
Οι βαλβιδοπάθειες με συχνότητα εμφάνισης 5% επί των ζώντων νεογνών αποτελούν το 20-30% του συνόλου των συγγενών καρδιοπαθειών. Οι καρδιακές βαλβίδες αναπτύσσονται και διαμορφώνονται ταυτόχρονα με το σχηματισμό της καρδιάς και όσο αυτή συστέλλεται. Οι βαλβίδες λειτουργούν καθ’όλη τη διάρκεια της ζωής ενός οργανισμού με σκοπό την παρεμπόδιση της παλίνδρομης ροής του αίματος μεταξύ των καρδιακών κοιλοτήτων. Η ακριβής τους διαμόρφωση είναι σημαντική για την φυσιολογική καρδιακή λειτουργία και είναι αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης της συσταλτικότητας της καρδιάς και της αιμοδυναμικής ροής. Ποικίλα σηματοδοτικά μονοπάτια εμπλέκονται στη μορφοποίηση των καρδιακών βαλβίδων. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν την ανάπτυξη τους δεν έχουν πλήρως διαλευκανθεί.Το zebrafish αποτελεί ένα ιδανικό πειραματικό μοντέλο για τη μελέτη της ανάπτυξης των καρδιακών βαλβίδων καθώς επιτρέπει τη μη επεμβατική in vivo παρατήρηση της ανάπτυξης του καρδιαγγειακού συστήματος. Επίσης, η καρδιά του, zebrafish έχει την ικανότητα να αναγεννάται σε όλη τη διάρκεια ζωής του ψαριού, προσφέροντας γνώση για την κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την αναγέννηση της ανθρώπινης καρδιάς. Το zebrafish είναι ακόμα ένα πολύτιμο γενετικό εργαλείο για την ταυτοποίηση υποψήφιων γονιδίων για συγγενείς καρδιοπάθειες, είτε μέσω του χαρακτηρισμού μεταλλαγμένων σειρών που έχουν προέλθει από γενετικούς ελέγχους είτε μέσω της φαινοτυπικής παρατήρησης εμβρύων μετά από εφαρμογή μεθόδων γονιδιωματικής τροποποίησης.Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός γονιδίων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και το σχηματισμό των καρδιακών βαλβίδων. Οι μεταλλαγμένες γενετικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν προήλθαν από τυχαία μεταλλαξιγένεση στα πλαίσια ενός ελέγχου πρόσθιας γενετικής για καρδιοαγγειακούς φαινότυπους. Η μεταλλαγμένη σειρά bua εμφανίζει στένωση της βαλβίδας στο σημείο εξώθησης της καρδιάς (outflow tract), με αποτέλεσμα την ελαττωματική ανάπτυξη της κολποκοιλιακής βαλβίδας και την παλινδρόμησή του αίματος μεταξύ κόλπου και κοιλίας. Τα έμβρυα της μεταλλαγμένης σειράς BH εμφανίζουν μικρότερη σε μέγεθος καρδιά και κυρτή ουρά. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε ο χαρακτηρισμός της διαγονιδιακής σειράς Tg(7xTCF-Xla.Siam:nlsmCherry). Πρόκειται για μια νέα διαγονιδιακή σειρά αναφοράς της Wnt/β-κατενίνης, που συμβάλλει στον εντοπισμό της ενεργότητας του σηματοδοτικού μονοπατιού στα κύτταρα του zebrafish. Ο χαρακτηρισμός του διαγονιδίου πραγματοποιήθηκε και στη μεταλλαγμένη σειρά apchu745, στην οποία το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt/β-catenin είναι μόνιμα ενεργοποιημένο. Έμβρυα zebrafish με μεταλλάξεις στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο apc (adenomatous polyposis coli) εμφανίζουν ανωμαλίες στην ανάπτυξη της καρδιάς, όπως ελαττωματική καρδιακή συσταλτικότητα, ελαττωματική κάμψη της καρδιάς, καθώς επίσης και υπερπλαστικά καρδιακά επάρματα στις καρδιακές βαλβίδες.Σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας ήταν η μελέτη της λειτουργίας των γονιδίων, η ταυτοποίηση νέων σηματοδοτικών μονοπατιών και η διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην παθογένεση των συγγενών καρδιοπαθειών. Αρκετά μοναδικά χαρακτηριστικά καθιστούν το zebrafish ένα ελκυστικό πειραματικό μοντέλο, που προσφέρει τη δυνατότητα μοντελοποίησης μεγάλου εύρους ανθρώπινων ασθενειών.
Adenomatous polyposis coli
Cite
Citations (0)
Expression (computer science)
Cite
Citations (0)
The Hox genes play a role in anteroposterior axis specification of bilaterian animals that has been conserved for more than 600 million years. However, some of these genes have occasionally changed their roles in evolution. For example, the insect gene fushi tarazu (ftz), although localised in the Hox cluster, no longer acts as a Hox gene, but is involved in segmentation and nervous system development. Recent data of Mouchel-Vielh et al., and Hughes and Kaufman on ftz homologues in a crustacean and a myriapod, respectively, shed new light onto the evolution of this gene.
Gene cluster
Cite
Citations (24)
Summary Gene expression programs determine cell fate in embryonic development and their dysregulation results in disease. Transcription factors (TFs) control gene expression by binding to enhancers, but how TFs select and activate their target enhancers is still unclear. HOX TFs share conserved homeodomains with highly similar sequence recognition properties, yet they impart the identity of different animal body parts. To understand how HOX TFs control their specific transcriptional programs in vivo , we compared HOXA2 and HOXA3 binding profiles in the mouse embryo. HOXA2 and HOXA3 directly cooperate with TALE TFs and selectively target different subsets of a broad TALE chromatin platform. Binding of HOX and tissue-specific TFs convert low affinity TALE binding into high confidence, tissue-specific binding events, which bear the mark of active enhancers. We propose that HOX paralogs, alone and in combination with tissue-specific TFs, generate tissue-specific transcriptional outputs by modulating the activity of TALE TFs at selected enhancers.
Cell fate determination
Cite
Citations (0)
Οι καρδιαγγειακές παθήσεις αποτελούν στην εποχή μας μία από τις πρώτες αιτίες θανάτου στον ανεπτυγμένο κόσμο. Επίσης, πολύ σημαντική είναι η συμβολή της αγγειογένεσης στην ανάπτυξη των καρκινικών όγκων. Καθίσταται λοιπόν αναγκαία η συμβολή της βασικής έρευνας ώστε να μελετηθούν καλύτερα οι μηχανισμοί των παθήσεων αυτών αλλά και να ανακαλυφθούν νέα φάρμακα που σχετίζονται με την αγγειογένεση. Τα τελευταία χρόνια σημαντικό ρόλο παίζει προς αυτές τις κατευθύνσεις το ζωϊκό πρότυπο μοντέλο zebrafish. Το zebrafish (Danio rerio) χρησιμοποιείται ευρέως ως ζωικό μοντέλο για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας των καρδιαγγειακών παθήσεων. Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται ο καρδιακός φαινότυπος υποτροφικού κόλπου, myh6-/-, σε ενήλικα ψάρια, τα οποία φέρουν μετάλλαξη στη βαριά αλυσίδα κολπικής μυοσίνης του zebrafish. Οι ομόζυγοι φορείς επιβιώνουν μέχρι την ενηλικίωση και είναι γόνιμοι. Στα ενήλικα μεταλλαγμένα ψάρια, ο κόλπος παραμένει υποπλαστικός και εμφανίζει εναπόθεση ελαστίνης, ενώ οι κοιλίες παρουσιάζουν αυξημένο μέγεθος. Στα θηλαστικά, η υπερτροφία είναι ο συνηθέστερος μηχανισμός που οδηγεί σε καρδιομεγαλία. Χρησιμοποιώντας την ανοσοϊστοχημεία και συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης για να μετρήσουμε το μέγεθος, την πυκνότητα και τον πολλαπλασιασμό των καρδιομυοκυττάρων, αποδεικνύεται ότι η μεγέθυνση της κοιλίας myh6-/- οφείλεται κατά κύριο λόγο στην υπερπλασία. Εντούτοις, εντοπίσαμε παρόμοια μεταγραφικά προφίλ στην απόκριση υπερτροφίας θηλαστικών μέσω RT-PCR των υπερπλαστικών κοιλιών. Περαιτέρω, δείχνουμε την ενεργοποίηση της οδού του στρες-ΕΔ με ανάλυση ανοσοαποτυπώματος κατά Western. Συμπερασματικά, μπορούμε να υποθέσουμε, με βάση το μοντέλο μας, ότι μονοπάτια μοριακής σηματοδότησης που συνδέονται με την υπερτροφία στα θηλαστικά, σε συνδυασμό με την ενεργοποίηση του στρες-ΕΔ, καταλήγουν σε υπερπλασία στο zebrafish. Επιπλέον, αυτή είναι η πρώτη φορά που αναφέρθηκε η εναπόθεση ελαστίνης στον κόλπο. Παράλληλα, μελετήθηκαν μικρά μόρια που αναστέλλουν την αγγειογένεση και είναι ελπιδοφόρα υποψήφια φάρμακα για τον καρκίνο, τις αμφιβληστροειδοπάθειες και τον εκφυλισμό της ωχράς κηλίδας που σχετίζεται με την ηλικία. Η in vivo φαινοτυπική διαλογή σε zebrafish (Danio rerio) αναδεικνύεται ως μια ισχυρή μεθοδολογία για την ταυτοποίηση και βελτιστοποίηση νέων ενώσεων με φαρμακολογική δράση. Το zebrafish παρέχει αρκετά πλεονεκτήματα για τις in vivo φαινοτυπικές παρατηρήσεις ειδικά για την αγγειογένεση, καθώς αναπτύσσεται ταχέως και δεν βασίζεται σε λειτουργικό καρδιαγγειακό σύστημα για να επιβιώσει για αρκετές ημέρες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιούμε μια διαγονιδιακή σειρά που επιτρέπει τη μη επεμβατική παρακολούθηση της αγγειογένεσης σε κυτταρικό επίπεδο. Η αναστολή της αγγειογένεσης μπορεί να παρατηρηθεί κάτω από ένα στερεοσκόπιο φθορισμού και να ποσοτικοποιηθεί. Εκμεταλλευόμενοι τις δυνάτοτητες του zebrafish, χρησιμοποιήσαμε μια σειρά από 60 καινοτόμες ενώσεις που σχεδιάστηκαν με βάση την αναστολή του υποδοχέα VEGFR2. Στα πειράματα αυτά μπορεί να να υπολογιστεί η συγκέντρωση στην οποία προκαλείται τοξικότητα και να καταδειχθούν πιθανές παρενέργειες των υπό εξέταση ουσιών. Με αυτόν τον τρόπο αποκαλύφθηκαν 6 αντιστρεπτοί αναστολείς της αγγειογένεσης. Τέλος, στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής επιχειρήθηκε να ανιχνευθούν γονίδια τα οποία παίζουν ρόλο στη μορφογένεση των καρδιακών βαλβίδων και να αποδειχθεί η σχέση τους μέσω στοχευμένης μεταλλαξιγένεσης με τη βοήθεια του συστήματος CRISPR-Cas και να δημιουργηθεί μια διαγονιδιακή σειρά zebrafish που να αποκρίνεται στις αλλαγές της διατμητικής τάσης. Συμπερασματικά, από την παρούσα διατριβή προκύπτει η μεγάλη δυνατότητα του zebrafish για ανασύσταση/αναδιαμόρφωση της καρδιάς του σε παθολογικές καταστάσεις και αποδεικνύεται η ικανότητά του να χρησιμοποιείται ως ιδανικό μοντέλο για τη μελέτη των καρδιαγγειακών παθήσεων.
Danio
Cite
Citations (0)
Developmental Biology
Cite
Citations (9)