Inhibition of HBV gene expression and replication in HepG2.2.15 cells by siRNA or shRNA expressing cassettes targeting HBV S gene

目的 化学合成针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA,同时制备针对相同区段的shRNA表达框,并比较二者对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用.方法 化学合成针对HBV S基因的带有FITC标记的siRNA,设计合成带有FITC标记的引物,PCR扩增含有RNA聚合酶Ⅲ启动子H1序列和shRNA编码序列的表达框,并对扩增产物进行纯化,将等摩尔数siRNA和shRNA表达框分别用脂质体转染稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞,转染1 d后流式细胞仪检测转染效率,转染3 d后RT-PCR检测靶基因mRNA的水平,用SDS-PAGE、Western blot及间接免疫荧光染色检测HBsAg的表达.收集转染前和转染后1、3、5和7 d的细胞培养上清,检测HBsAg水平,同时用荧光定量PCR方法检测HBV DNA的含量.结果 成功制备了针对HBV S基因的shRNA表达框,将其与等摩尔数siRNA分别转染HepG2.2.15细胞后,RT-PCR证实细胞中HBV mRNA水平降低,SDS-PAGE、Western blot及间接免疫荧光染色检测到HBsAg的表达受到抑制,细胞培养上清中HBsAg和HBV DNA含量下降.与siRNA相比,shRNA表达框对HBV的抑制作用虽然起效较慢,但持续时间更长.结论 shRNA表达框和siRNA均可明显抑制HBV的转录和表达,与siRNA相比,shRNA表达框能够更持久地抑制靶基因的表达。