Estudio de los mecanismos que coordinan la actividad de los centros organizadores de microtúbulos de las células animales

La organizacion del citoesqueleto de microtubulos (MTs) asi como el control del numero absoluto de estos es esencial en la regulacion de diferentes procesos celulares tales como la division celular, el trasporte direccional de proteinas o el establecimiento de la polaridad celular. La distribucion de esta red no se establece de forma aleatoria, sino que depende de la localizacion y activacion de los sitios intracelulares desde donde los MTs son nucleados. Esta nucleacion tiene lugar en estructuras morfologicas definidas que se denominan centros organizadores de microtubulos (MTOCs) (Luders and Stearns 2007). En celulas animales en division, el centrosoma actua como el principal MTOC celular (Bornens 2002), sin embargo, el Aparato de Golgi (AG) tambien presenta capacidad para nuclear MTs en celulas en interfase (Efimov et al. 2007). La actividad de estos dos sitios de nucleacion de MTs varia a lo largo del ciclo celular sugiriendo la existencia de algun tipo de regulacion coordinada de sus respectivas actividades. AKAP450, CDK5Rap2 y pericentrina (PCNT) son tres de las principales proteinas descritas como posibles reguladoras de dicho mecanismo de nucleacion y presentes en ambos organulos. Asi, en esta tesis, hemos llevado a cabo un analisis de los mecanismos implicados en el control del comportamiento coordinado de los diferentes MTOCs celulares combinando la eliminacion de estos tres principales factores reclutadores de complejos γTuRC (AKAP450, CDKRap2 y PCNT) y el uso del recientemente descubierto inhibidor de PLK4 (proteina esencial en la duplicacion del centrosoma) centrinona. Los resultados presentados demuestran que las proteinas implicadas tradicionalmente en el reclutamiento de complejos γTuRC no son esenciales para la nucleacion de MTs desde el centrosoma en interfase; mientras que si van a controlar esta funcion en el AG. Varias lineas argumentales apoyan esta conclusion. Primera, la inhibicion de la expresion de AKAP450, CDK5Rap2 y PCNT en celulas hTERTRPE1 no afecta a los niveles de nucleacion desde el centrosoma ni al reclutamiento de γ-tubulina. Centrosomas carentes de las tres proteinas son capaces de nuclear MTs a ratios normales gracias a la funcion de CEP192; quien si parece ejercer una contribucion importante pero no esencial en este mecanismo. Segunda, celulas carentes de estas cuatro proteinas aun presentaban cierta capacidad de nucleacion de MTs desde el centrosoma, lo que demuestra la existencia de mecanismos adicionales a los generalmente considerados como canonicos. Tercero, en el caso del AG, es ya conocido que su capacidad para nuclear MTs depende de la presencia de AKAP450 (Rivero et al. 2009), y nuestros resultados demuestran que tanto CDK5Rap2 como pericentrina tambien influyen en estos niveles. Asi, celulas carentes de CDK5Rap2 presentaban una menor capacidad de nucleacion desde el AG mientras que en el caso de la ausencia de pericentrina, esta actividad se veia claramente potenciada; lo que indica el papel inhibitorio de la proteina. Ensayos de coinmunoprecipitacion revelaron la existencia de dos tipos de complejos capaces de reclutar γTuRCs; aquellos basados en AKAP450 y los basados en pericentrina. Ambos desempenan funciones antagonicas en los mecanismos de nucleacion desde el AG y son totalmente dispensables en el papel del centrosoma como MTOC. Es conocido que en procesos de diferenciacion celular los diferentes MTOCs experimentan mecanismos de desregulacion, permitiendo potenciar o limitar su actividad de manera controlada. Nuestros resultados apoyan la idea de que la nucleacion de MTs es un proceso con una jerarquia intrinseca en la que el centrosoma ocupa un lugar principal. Ensayos con la droga centrinona RESUMEN 10 demostraron que la ausencia de centrosoma provoca una estimulacion significativa de la nucleacion de MTs desde el AG; mientras que la presencia de centrosomas extras inhibe dicho mecanismo. Asi, la perdida o ganancia de centrosomas tiene un impacto en el comportamiento como MTOC del AG; situacion que no ocurre de forma inversa como por ejemplo cuando se inhibe la nucleacion de MTs desde el AG mediante la eliminacion de AKAP450. Dado que la ausencia de PCNT estimula la capacidad de nucleacion del AG de forma similar a como lo hace la ausencia del centrosoma, aunque en menor grado; nuestros datos parecen indicar que el efecto regulatorio del centrosoma sobre la funcion del AG podria estar mediado por el reclutamiento de la propia pericentrina a esta localizacion. En este sentido, nuestros experimentos tambien revelaron como los MTs son nucleados en celulas con sus dos principales MTOCs inactivos. Asi, en estas condiciones, observamos la formacion de estructuras acentriolares bien definidas capaces de nuclear MTs desde localizaciones discretas no asociadas ni al AG ni al centrosoma. El analisis en profundidad de dichas estructuras revelo que estos MTOCs acentriolares no se originan por un simple incremento de los niveles citoplasmicos o la localizacion ectopica de las proteinas centrosomicas; sino que presentan un claro ensamblaje regulado siendo la pericentrina un componente esencial y necesario para su conformacion. En todos los casos, el proceso de nucleacion siempre era dependiente de γ-tubulina. Finalmente, los estudios con centrinona mostraron que bajo cualquier condicion experimental que implicara la ausencia de centrosomas, la densidad de MTs celular se duplicaba en comparacion a las condiciones controles. Incremento que se observa independiente del sitio desde donde los MTs son nucleados; ya sea el AG (celulas controles tratadas con centrinona) o los MTOCs citoplasmicos (celulas akap450 knock-out sin centrosoma). Estos datos indican que el centrosoma parece controlar el numero absoluto de MTs existente en la celula, asi como la distribucion espacial de estos, no solo por medio de un proceso de nucleacion activa, sino en parte tambien al actuar a modo de regulador negativo de la actividad de los demas MTOCs alternativos. Sorprendentemente, este incremento de la densidad de MTs generada por la ausencia de centrosomas no se repite en celulas carentes de pericentrina, sugiriendo que esta constituye un factor clave en la conexion y regulacion del efecto que la perdida del centrosoma tiene en la capacidad de nucleacion de MTs desde el AG. Asi, en este trabajo revelamos la existencia de un mecanismo mediante el cual el centrosoma es capaz de controlar el numero y la distribucion espacial de los MTs de celulas en interfase. Regulacion que lleva a cabo no solo controlando su propia actividad, sino tambien la de otros MTOCs alternativos; especialmente el AG. Por su parte nuestros resultados parecen tambien indicar que la pericentrina desempena un papel esencial en esta regulacion, actuando a modo de coordinador global del conjunto del proceso de nucleacion de MTs.