LA QUITINA DESACETILASA DE Bacillus thuringiensis CEPA Bt-132

La cepa B. thuringiensis Bt-132 produce una desacetilasa periplasmica e inespecifica, la cual desacetila sustancias tan distintas como glicol-quitina, EDTA, acetato de uranilo, p-nitrofenilacetato y acido 2,4-dicloro-fenoxiacetico. Es posible entonces que la cepa pueda desacetilar sustancias xenobioticas. Esta enzima se sintetiza constitutivamente. En este trabajo se investigo la actividad de esta quitina desacetilasa (QDA), usando glicol-quitina como sustrato. Para su purificacion y caracterizacion se produjo primero en caldo nutritivo. Su extraccion y solubilizacion, se llevo a cabo lisando celulas colectadas en la parte media de la fase logaritmica de crecimiento, mediante ruptura mecanica con diversos abrasivos, aplicando agitacion vigorosa, friccion, presion o sonicacion. Sin embargo, los mejores rendimientos se obtuvieron al autolisar las celulas en condiciones de agitacion (280 rpm), a 28 °C durante 96 h. Los autolisados clarificados y libres de celulas se concentraron por liofilizacion, luego se fracciono por cromatografia de hidrofobicidad en una columna de fenil sefarosa CL 4B, eluyendo en un gradiente decreciente y discontinuo de sulfato de amonio. La enzima eluyo rapidamente, mostrando ser poco hidrofobica. Para una posterior purificacion y eliminacion del sulfato de amonio proveniente del paso anterior, se realizo una cromatografia en gel utilizando una columna de sephadex G-25. De este modo se logro purificar la QDA hasta homogeneidad molecular, comprobada esta mediante PAGE-SDS usando la tincion con nitrato de plata. Mediante este proceso la enzima se purifico 33 veces, con un rendimiento de 11 %, valores que son satisfactorios si se comparan con los reportados por otros autores. La enzima pura mostro un peso molecular de 60.2 kDa, y se inactivo rapidamente al dializarla contra EDTA, indicando ser una metaloenzima. Ya inactivada con EDTA, la QDA se reactivo al adicionarle sales de metales divalentes como ZnCl2, CaCl2, MgCl2 y CoCl2. La recuperacion fue mas notoria con el ion Zn++, como ha sido reportado en otras QDA. La maxima estabilidad y mayor actividad de la enzima ocurrio a pH 4.5, y aunque su termoestabilidad es alta, la temperatura optima de reaccion se observo a 40 °C, valor mas bajo que los reportados, los cuales oscilan entre 50-60 °C. Las QDAs estudiadas hasta ahora han sido de origen fungico, de lavaduras y de unas pocas bacterias. Este es el primer reporte concerniente a la purificacion y caracterizacion de la QDA de B. thuringiensis.