Contribution à l'amélioration de la quantification des acides nucléiques par qPCR et RT-qPCR

La qPCR est actuellement la technique de reference en matiere de quantification d'ADN. Elle peut etre definie comme une amplification exponentielle, cyclique et ciblee de la sequence d'ADN cible. Le caractere exponentiel de la qPCR est a la fois a l'origine de la sensibilite de la methode mais aussi d'une potentielle variabilite inter-echantillons. Cette variabilite est compensee par le caractere cyclique de la methode qui entraine une synchronisation de la reaction pour tous les echantillons a chaque cycle. L'amplification ciblee de la sequence choisie traduit quand a elle la specificite de la methode. Neanmoins, cette derniere propriete de la PCR reste la moins verifiee. La specificite de la qPCR est indiscutable lorsque la cible a detecter se trouve en quantite suffisante (>100 copies environ). En revanche, pour des quantites plus faibles ou en presence d'inhibiteurs, la specificite diminue ou disparait (limites de detection et de quantification). Cette perte de specificite retentit de facon significative sur la precision et la reproductibilite du dosage a realiser. Cependant, si l'hybridation non specifique est ineluctable dans ces conditions, l'amplification non specifique consecutive peut etre limitee, voire supprimee au moyen d'amorces de PCR soit plus specifiques, soit moins susceptibles de generer des differences inter-echantillons. La RT-qPCR, grâce a une etape initiale de transcription inverse (conversion d'un ARN en un ADN complementaire) permet la quantification des ARN. Cependant, la transcription inverse reste moins reproductible que la PCR, generant des differences inter-echantillons deleteres en diagnostic comme en recherche. Au cours de ces travaux, je propose des methodes originales ameliorant de facon significative differentes etapes de ces techniques. Premierement, je propose une amelioration de la standardisation de l'etape de transcription inverse capable de diminuer de facon significative la variabilite inter-echantillons ; l'utilisation d'un volume constant d'extrait d'ARN pour chaque echantillon ameliore considerablement la precision de la quantification d'ARN messagers. Deuxiemement, je propose une modification des amorces par incorporation de residus d'acides nucleiques bloques (LNA) ; cette modification permet d'augmenter la specificite des amorces aux limites de la detection. Enfin, je propose une methode simple et economique permettant la mesure directe de la temperature de fusion (Tm) dans les conditions reelles de la PCR. Ce parametre, considere comme capital pour la realisation des dosages par qPCR, est generalement obtenu par des methodes predictives peu precises. De plus, cette methode doit permettre de determiner precisement les parametres thermodynamiques des amorces (∆G, ∆H et ∆S) et ainsi avoir acces d'une part au pourcentage reel d'amorces hybridees en fonction de la temperature et d'autre part d'identifier la susceptibilite des amorces aux inhibiteurs.