Entwicklung und Anwendung eines neuen murinen intestinalen in vitro Testsystems

Der Dunndarm ist an der Aufnahme von Nahrungsbestandteilen beteiligt und liefert den ersten Kontakt zu Pathogenen. Er stellt den grosten Teil des Immunsystems dar und aus diesem Grund ist es besonders wichtig, dass die unterschiedlichen Zelltypen ihren verschiedenen spezialisierten Aufgaben nachkommen. Der Darm besteht aus Krypten, wobei die intestinalen Stammzellen in der Nische sitzen und in der Lage sind in alle Zelltypen des Dunndarms - Panethzellen, enteroendokrine Zellen, Gobletzellen und Enterozyten - zu differenzieren. In dieser Arbeit wurden ausgehend von murinen intestinalen Krypten, die in vitro als Organoidkulturen expandiert wurden, neuartige Zelllinien etabliert. Fur diesen Prozess wurde zunachst eine Transduktionsstrategie fur die Organoidkulturen optimiert und insgesamt 42 neue Zelllinien immortalisiert. Nachfolgend wurden die immortalisierten Zellen auf die Expression von verschiedenen Zelltyp-spezifischen Eigenschaften untersucht, um die vielversprechendsten Zelllinien zu identifizieren. Aus den initialen Charakterisierungen wurden ca. 10 Linien ausgewahlt, die eingehender charakterisiert wurden. Dabei zeigte sich, dass die Zelllinien enge Zell-Zell-Kontakte aufwiesen, die durch Zonula Occludens-1 (ZO-1) und Ecadherin Expression sowie mittels einer Barrieremessung nachgewiesen wurden. Weiterhin konnte mithilfe der Elektronenmikroskopie gezeigt werden, dass die Zellen teilweise Mikrovilli ausbildeten. Auserdem zeichneten sich die Zelllinien durch eine fur Gobletzellen-charakteristische Schleimproduktion aus, die sowohl auf RNA und Proteinebene als auch funktional nachgewiesen wurde. Zudem zeigten die Zelllinien Markerexpression von enteroendokrinen Zellen (Serotonin-Sekretion) und von Panethzellen (Defensin, Lysozym, CD24-Expression). Abschliesend wurden die Zellen erneut in komplexe 3D-Umgebung uberfuhrt und bildeten Organoid-Strukturen aus. Die Daten deuten darauf hin, dass die neuartigen Zelllinien nicht terminal differenziert sind, sondern Vorlauferzellen. Um die generelle Anwendbarkeit dieser Zellen zu verbessern, wurde ein Medium neu entwickelt, welches die zellularen Eigenschaften erhalt. Daruber hinaus konnte in einer ersten Studie mit einem enteropathogenen E. coli (EPEC) gezeigt werden, dass durch das TypIII-Sekretionssystem die zellulare Barriere aufgelost wird und der Erreger den Wirt infizieren kann.