基于颜色判定的RT-LAMP技术检测HCoV-NL63冠状病毒基因

建立了一种适合于国境口岸简便、快速、灵敏和特异检测人冠状病毒NL63（HCoV-NL63）的核酸检测方法。通过建立基于颜色判定的逆转录环介导等温扩增（Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP）技术,针对HCoV-NL63核衣壳蛋白（Nucleocapsid,N）基因序列设计出6条特异性引物,在等温条件下（63℃）进行扩增反应60min,在扩增前加入钙黄绿素作为反应指示剂,并结合浊度仪进行实时监测,以最终反应颜色变化作为结果判断标准。利用该方法对同种属其他人冠状病毒、诺如病毒、流感病毒进行检测,以分析该方法的诊断特异性。应用该方法对梯度稀释的HCoV-NL63病毒RNA进行检测,以分析该方法的诊断灵敏性,并与常规real-time RT-PCR方法进行比较。结果显示,本研究建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法在短时间内（40min）即可达到对HCoV-NL63的快速检测。该检测方法与加入其它病毒RNA模板溶液颜色均不产生改变,具有较高的检测特异性。检测灵敏性最低检测下限为1 600拷贝/反应。本研究建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法可实现对HCoV-NL63冠状病毒现场快速检测,具有在国境口岸以及基层医疗机构和疫区现场推广应用的潜力。