操纵茶树类黄酮3'-羟基化酶生物合成B环-3', 4'-二羟基黄酮类化合物

目的操纵茶树类黄酮3'-羟基化酶，生物合成B环-3'，4'-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素。 方法构建了4个茶树类黄酮3'-羟基化酶基因（ CsF3'H ）和拟南芥的P450还原酶基因（ ATR ）融合表达质粒：SUMO-CsF3'H[7-517]：：ATR1[49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[28-517]：：ATR1[49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[7-517]：：ATR2[75-711]3 AA和SUMO-CsF3'H[28-517]：：ATR2[75-711]3 AA，分别转化大肠杆菌菌株TOP10、DH5α和BL21，获得12个转化菌株S1-S12；构建了茶树类黄酮3'-羟基化酶基因 CsF3'H 表达质粒pYES-Dest52-CsF3'H，转化酵母菌株WAT11，得到转化菌株S13；构建了茶树类黄酮3'-羟基化酶基因 CsF3'H 表达质粒pES-URA-CsF3'H，及茶树黄烷酮3-羟基化酶基因 CsF3H 与拟南芥黄酮醇合成酶基因 AtFLS 的融合表达质粒pES-HIS-CsF3H：：AtFLS 9AA，二者共转化酵母菌株WAT11，获得转化菌株S14。 结果转化SUMO-CsF3'H[28-517]：：ATR1[49-688]3 AA质粒的TOP10菌株S6在25℃条件下发酵，转化效率最高，能将1000 μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚，分别转化生成287.93 μmol/L圣草酚、131.76 μmol/L二氢槲皮素和188.62 μmol/L槲皮素。发酵菌株S13能分别将1000 μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚，最多能转化生成734.32 μmol/L圣草酚、446.07 μmol/L二氢槲皮素和594.64 μmol/L槲皮素。喂食S14发酵菌株5 mmol/L的底物柚皮素，在发酵36-48 h中，最多能生成1412.16 μmol/L圣草酚、490.25 μmol/L山奈酚、445.75 μmol/L槲皮素、66.75 μmol/L二氢槲皮素和73.50 μmol/L二氢山奈酚。 结论本研究首次将茶树类黄酮3'-羟基化酶基因应用于B环-3'，4'-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素的生物合成。