Construction d’une souche de Candida lusitaniae génétiquement modifiée pour l’étude des mutations de résistance aux échinocandines

Introduction Les echinocandines alterent la synthese de la paroi fongique en inhibant la β-(1-3)-D-glucane synthetase, codee par les genes FKS . Des mutations dans deux regions « Hot Spot » (HS) tres conservees des genes FKS ont ete decrites dans des cas de resistances acquises aux echinocandines chez les levures Candida . Les souches resistantes sont caracterisees au niveau phenotypique (mesure des CMIs et de l’activite enzymatique) et genotypique (sequencage generalement limite aux regions HS). Faute d’un bon modele biologique, et a cause de la grande taille des genes FKS (5–6 kb), peu de mutations ont ete caracterisees par remplacement d’allele chez les levures Candida . L’objectif de ce travail est de construire une souche de Candida lusitaniae genetiquement modifiee pour exprimer des alleles FKS mutes. Materiel et methodes C. lusitaniae est une levure haploide appartenant au clade CTG des Candida. La souche utilisee est une souche auxotrophe pour le tryptophane et l’uracile (6936  ura3 Δ990  trp1 Δ798), dans laquelle des demi-marqueurs d’auxotrophie trp1  et ura3  ont ete implantes dans les regions 5′ et 3′ du gene FKS1 . Le remplacement de l’allele resident sauvage FKS + est effectue par l’apport de deux fragments d’ADN qui vont reconstituer des marqueurs d’auxotrophie fonctionnels de part et d’autre du gene FKS . Un fragment porte la partie 3′ du gene TRP1  et la partie 5′ du gene FKS mut , et un fragment porte la partie 3′ du gene FKS mut et la partie 5′ du gene URA3 . Ces deux fragments sont co-transformes dans la souche receptrice, recombinent in cellulo pour former un seul fragment qui s’integre au locus FKS par double crossing-over. Cette recombinaison aboutit a une souche prototrophe exprimant l’allele FKS mut . Resultats Trois mutations deja connues du gene FKS ont ete introduites pour la validation du modele : les mutations F641V et S645P dans HS1 et R1361G dans HS2. A l’issue du remplacement d’allele, les CMIs aux echinocandines ont ete determinees par la methode des E-Test et par dilution en milieu liquide. Conclusion Cette souche de C. lusitaniae genetiquement modifiee pour permettre l’expression d’un allele FKS complet ouvre de nouvelles perspectives pour l’etude d’une grande diversite de mutations, notamment dans les regions hors HS, et pour l’expression heterologue de differents alleles de Candida spp. chez C. lusitaniae .