联苯利用节杆菌YC-RL1中2, 3-二羟基联苯-1, 2-双加氧酶BphC功能验证

目的通过节杆菌( Arthrobacter sp.) YC-RL1对多氯联苯降解过程中关键基因 bphC 的克隆与原核表达，鉴定其编码的2, 3-二羟基联苯-1, 2-双加氧酶BphC的酶活特性与功能。 方法以菌株YC-RL1全基因组为模板进行PCR扩增获得 bphC 基因，将该基因转入 Escherichia coli BL21(DE3) 感受态细胞后进行原核表达；利用镍柱亲和层析法对BphC酶进行纯化并分别测定该酶在不同条件下对底物2, 3-DHBP的催化特性，确定其最适反应pH、温度及不同金属离子对酶活特性的影响；进一步根据米氏方程对该酶的动力学参数进行测定与分析。 结果通过PCR扩增获得了 bphC 基因，其大小为930 bp；对该基因进行原核表达，所得重组蛋白BphC携带有6个组氨酸标签，经纯化后体外仍具有活性，该酶作用于2, 3-DHBP时的最适pH与温度分别为pH 7.4和30 ℃，且在最适条件下，Fe 2+ 、Cu 2+ 及Cd 2+ 等金属离子可明显促进其酶活作用，但多数金属离子对该酶有不同程度的抑制作用；该酶在与底物2, 3-DHBP作用过程中，酶促动力学常数分别为 K m ：8.67 mmol/L， V max ：27.32 μmol/s， k cat ：15.55 s –1 ， k cat / K m ：1.79 L/(mmol·s)，其催化效率同有关报道中同类酶的动力学特性比较均有所提高。 结论菌株YC-RL中的 bphC 基因对于多氯联苯的生物降解具有至关重要的作用，其编码的BphC是重要的芳香环裂解酶，该酶对其底物具有较高的亲和性，可在体外环境中发挥高效的酶促作用，具有良好的应用价值。