Células madre mesenquimales equinas: Obtención y análisis de sus propiedades in vitro

Las celulas madre mesenquimales (MSCs) presentan una capacidad de autorrenovacion y diferenciacion a linajes derivados del mesodermo que las hacen idoneas para su aplicacion en el tratamiento de lesiones del aparato locomotor en la especie equina. Las lesiones mas comunes que sufren los caballos de carreras afectan a tejidos como el tendon o cartilago, que presentan una capacidad muy limitada de reparacion. Las MSCs pueden contribuir a la formacion de un tejido con propiedades similares a las del tejido sano y evitar asi el riesgo de recaidas. Para poder aplicar con garantias las MSCs a la clinica equina es fundamental el conocimiento de sus caracteristicas. Por ello, en el presente trabajo de Tesis Doctoral se han estudiado las caracteristicas de las MSCs equinas derivadas de medula osea (BM-MSCs) y tejido adiposo (AT-MSCs) tanto en condiciones estandar de cultivo (20% O2), como en condiciones denominadas de hipoxia (5% O2), mas similares a la concentracion de oxigeno fisiologica que rodea a las celulas in vivo. Antes de caracterizar las MSCs se realizo un ensayo para valorar la influencia del tiempo que transcurre entre la toma de muestras y el aislamiento de las celulas sobre su capacidad de autorrenovacion. El retraso sufrido en el aislamiento de las celulas supuso una perdida de MSCs, ya que el numero de colonias obtenidas fue significativamente mayor cuando el aislamiento se llevo a cabo inmediatamente despues a la obtencion del tejido que 24 horas despues. A continuacion se estudio la capacidad de proliferacion de las MSCs y su potencial de diferenciacion hacia linajes osteogenico y adipogenico. Los resultados mostraron que las AT-MSCs dieron lugar a mayor numero de celulas en cultivo que las BM-MSCs. Ambos tipos celulares se diferenciaron hacia osteoblasto, presentando un limitado potencial adipogenico. Posteriormente se determino el fenotipo de las BM-MSCs y AT-MSCs respecto a la expresion de ciertos marcadores de superficie por citometria de flujo y PCR cuantitativa en tiempo real. Las MSCs equinas mostraron un perfil de expresion similar al de la especie humana, observandose diferencias en la expresion de ciertos marcadores entre BM-MSCs y AT-MSCs. Por otra parte, el cultivo en condiciones de hipoxia no modifico la capacidad de expansion, fenotipo o potenciales osteogenico y adipogenico de las BM-MSCs. Sin embargo, la condrogenesis se vio potenciada por esta condicion. El estudio de la evolucion del ciclo celular y la viabilidad de las MSCs de ambos origenes en las dos condiciones de oxigeno mostro que los cultivos en normoxia presentaron mayor numero de celulas, debido a una mayor actividad en la division celular en las BM-MSCs y a una mayor viabilidad de los cultivos de las AT-MSCs. Ademas, las MSCs mostraron una tendencia a una mayor expresion de marcadores de pluripotencia en hipoxia, lo que indicaria que estas celulas se encontraban en un estado menos diferenciado. Las diferencias en las caracteristicas de las MSCs in vitro podrian estar relacionadas con variaciones en su capacidad terapeutica in vivo. Por ello, y como parte de un estudio pre-clinico de tratamiento de lesiones tendinosas en caballos, se analizo el fenotipo y potencial de diferenciacion osteogenico, adipogenico y condrogenico de las BM-MSCs y AT-MSCs utilizadas en dicho estudio. Los resultados confirmaron los obtenidos anteriormente para el fenotipo y potencial osteogenico. Ademas, ambos tipos celulares mostraron similar capacidad de diferenciacion adipogenica. Sin embargo, en nuestras condiciones experimentales, aunque las BM-MSCs se diferenciaron claramente hacia condrocito, las AT-MSCs mostraron un limitado potencial de diferenciacion hacia ese linaje.