Charakterisierung des Regulatorischen Komplexes von 26S Proteasomen aus Drosophila melanogaster

26S Proteasomen aus Drosophila melanogaster sind hinsichtlich ihrer Stabilitat jenen aus vielen anderen Organismen uberlegen und daher besonders fur Strukturuntersuchungen geeignet. Fur eine biochemische Charakterisierung wurden im Zuge dieser Arbeit 26S Proteasomen aus D. melanogaster Embryonen gereinigt und mittels 2D Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Untereinheiten des Regulatorischen Komplexes (RC) wurden mittels Aminosauresequenzierung und anschliesender Sequenzierung der korrespondierenden cDNA identifiziert. 17 Untereinheiten des Drosophila RC haben Homologe in den RC von Hefe und Mensch. Eine zusatzliche Untereinheit, p37A, die bis jetzt in anderen Organismen noch nicht beschrieben wurde, gehort zur Familie der Ubiquitin - C-terminalen - Hydrolasen (UCH). Unter Ausnutzung der kovalenten Bindung des nicht hydrolysierbaren Substratanalogen, Ubiquitinaldehyd, an p37A konnte erstmals mittels Elektronenmikroskopie die Lage einer Untereinheit im Regulatorischen Komplex direkt bestimmt werden. Die Massen des 26S Proteasoms mit einem oder zwei RC wurde mit Hilfe von Rastertransmissions-Elektronenmikroskopie (STEM) ermittelt; die daraus berechnete Masse des Regulatorischen Komplexes betragt 894 kD. Dieser Wert entspricht ziemlich genau der Summe der Massen der 18 Untereinheiten von 932 kD; folglich wurden tatsachlich alle RC Untereinheiten durch die 2D Gelelektrophorese detektiert. p37A und andere Untereinheiten des Drosophila 26S Proteasoms wurden molekularbiologisch mit einem Epitop versehen und in stabil transfizierten Drosophila Schneider S2 Zellen uberexprimiert. Diese Fusionsproteine wurden von den Zellen in Proteasomen eingebaut und uber Epitop-spezifische Affinitatschromatographie gereinigt. Neben den freien Untereinheiten konnten mit dieser Methode 20S Proteasomen bzw. Regulatorische Komplexe, jedoch keine kompletten 26S Proteasomen isoliert werden. Die Epitop-markierten Komplexe konnten sich in Zukunft als nutzlich fur die Lokalisierung einzelner Untereinheiten mittels Immunoelektronenmikroskopie erweisen.