New thérapeutic strategies for the treatment of B-hemoglobinopathies.

Le developpement de strategies therapeutiques curatives pour les patients affectes de β-hemoglobinopathies, c’est a dire drepanocytose et β-thalassemies, fait face a une grande demande. En effet, un acces restreint a des donneurs compatibles limite l’unique therapie definitive autorisee, la transplantation allogenique de cellules souches hematopoietiques (CSH). Au cours de la premiere partie de cette these,nous avons optimise une alternative therapeutique,la transplantation autoloque de CSH corrigees par le biais de lentivirus (LV). Le developpement de lentivirus exprimant la β-globine et l’amelioration des conditions de transduction des CSH a debouche sur de probants benefices cliniques pour les patients drepanocytaires et thalassemiques traites par cette approche dans le cadre d’essais cliniques recents. Malgre ces progres majeurs,cette therapie pourrait beneficier d’ameliorations. En effet,la correction de thalassemies majeures, dependantes de transfusion, ainsi que de la drepanocytose requiert de forts niveaux d’expression du transgene. Le but de ce projet est de choisir un LV a titre eleve, capable de transduire une large portion de CSH et d’entrainer une forte expression du transgene dans des globules rouges (GR) derives de CSH. A cet effet, nous avons compare differentes combinaisons d’elements regulateurs afin de definir la cassette regulatrice minimale necessaire pour l’obtention de forts niveaux d’expression de la β-globine. Nous avons construit 2 mini-LCRs contenant soit HS2 et HS3 (taille totale 2.6 kb) ou HS2, HS3 et HS4 (taille totale 3.7 kb) provenant du Locus Control Region (LCR). Ces cassettes ont ete inserees dans les LV β-AS3 et β-AS3 HS4, respectivement, qui controlent l’expression d’une globine anti-falciformante, βAS3-globine.Premierement, nous avons comparativement evalue l’efficacite de transduction des vecteurs β-AS3 et β-AS3 HS4 dans des cellules souches progeniteurs hematopoietiques (CSPH) drepanocytaires et dans des CSH drepanocytaires. Le deuxieme volet de cette etude a permis de determiner l’expression de la βAS3-globine issue de ces deux constructions dans des GR derives de CSPH drepanocytaires, et d’evaluer l’efficacite du LV le plus efficace pour secourir le phenotype drepanocytaire.La seconde partie de cette these vise a developper une nouvelle strategie therapeutique par edition du genome pour reactiver l’hemoglobine fœtale (HbF). Cette approche s’appuie sur l’observation d’une meilleure evolution clinique des β-thalassemies et de la drepanocytose en presence de niveaux eleves d’HbF.Par l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas9, nous avons invalide les sites de liaisons de represseurs transcriptionnels au niveau des promoteurs de la γ-globine pour reactiver l’expression de l’HbF dans des GR derives de CSPH drepanocytaires. La reactivation des genes de γ-globine fœtale dans leur locus genomique endogene permet de s’affranchir des difficultes liees a l’expression relativement faible de transgene par copie de LV, principalement lie a la faible capacite des LV qui ne permet d’inserer que de courts fragments d’ADN du LCR, arranges de maniere non-physiologique. De plus,cette strategie offre une approche potentiellement plus sure comparee a une strategie addition de gene basee sur l’usage de LV. Dans la drepanocytose, cette approche therapeutique favorise l’expression de la γ-globine anti-falciformante aux depens de la globine βS-globine mutee. Dans le cadre d’une approche comparative,nous avons evalue des cibles therapeutiques connues et nouvelles au niveau des promoteurs de la γ-globine. A cet effet, plusieurs ARN guides (ARNg) ont ete designes pour cibler 3 regions des promoteurs de la γ-globine, ou des variants associes a des niveaux eleves d’HbF et/ou a des sites de liaison de represseurs de l’HbF ont ete decrits.