Importancia funcional de la Pro80 para la interacción con membranas y la formación de poros por la sticholysina I, actinoporina de Stichodactyla helianthus (Anthozoa: Stichodactylidae)

Resumen: La sticholisina I (StI) es una actinoporina producida por la anemona de mar Stichodactyla helianthus . Aunque no se conoce con exactitud el mecanismo molecular de formacion de poros de las actinoporinas se plantea que transcurre por varias etapas: la union inicial a la membrana, la oligomerizacion, el despliegue del segmento del extremo amino y la formacion final del poro transmembrana. La estructura tridimensional de las actinoporinas se caracteriza por un nucleo central de hojas-b intercaladas flanqueado por dos helices-a, un sitio de union interfacial mediante el cual interactuan con los lipidos de las membranas, y lazos que interconectan las fibras b. La region estructural de las actinoporinas menos estudiada es la de los lazos localizados hacia el sitio de interaccion con la membrana. El lazo b4-b5, que comprende los residuos 76 al 84 de StI, es uno de los de mayor flexibilidad conformacional de la proteina. Con el objetivo de evaluar la contribucion de esta region al mecanismo de formacion de poros se diseno y obtuvo el mutante StI P80C. El residuo de Pro 80 es el mas expuesto dentro del lazo b4-b5 y se encuentra conservado en la familia de las actinoporinas. La proteina mutante StI P80C se expreso en el sistema de Escherichia coli y se purifico en un solo paso mediante cromatografia de intercambio cationico. La introduccion de un residuo de cisteina en la posicion 80, no altero los rasgos conformacionales de la toxina segun los estudios de espectroscopia de fluorescencia y dicroismo circular. Esta sustitucion aminoacidica no afecto la capacidad de union de StI a membranas modelo, sin embargo, modifico su actividad permeabilizante frente a eritrocitos humanos y liposomas. Los resultados sugieren que la Pro 80 de StI pudiera participar en un evento o etapa posterior a la union inicial a las membranas y previa a la formacion del poro funcional. Palabras clave: citolisinas, fluorescencia, dicroismo circular, proteina formadora de poros, permeabilizacion de membranas, mutantes de Cys ABSTRACT: Sticholysin I (StI) is an actiporin produced by the sea anemone Stichodactyla helianthus . The mechanism of pore formation by actinoporins is a multistep process, involving binding of the water-soluble monomer to the membrane and subsequent oligomerization on membrane surface, leading to the functional pore formation. However, the molecular details of the mechanism of membrane insertion and oligomerization have not been completely clarified yet. The tridimensional structure of actinoporins display a common fold characterized by a b -sandwich core flanked by two a -helices, a membrane recognition site and loops interconnecting all b-sheets. The less studied structural regions of actinoporins include the loops located at the protein-membrane interaction face. The loop that connects b 4 and b 5 strands, comprising residues 76–84 of StI, displays the highest conformational flexibility of the whole protein in solution. In order to get insights into the contribution of this region to the actinoporins pore forming mechanism, we devised and obtained the mutant StI P80C. Pro 80 is the most solvent-exposed residue in the b 4- b 5 loop and is well conserved along the actinoporin protein family. StI P80C was expressed in a bacterial system and purified in a single step by cation exchange chromatography. The conformational characterization derived from fluorescence and CD spectroscopic studies of StI P80C revealed that replacement of Pro 80 by Cys in StI did not noticeably change the conformation of the protein in solution. Interestingly, this amino acid substitution did not affected StI binding to membrane, whereas provoked noticeable changes in its permeabilizing activity both in erythrocytes and liposomes. These results suggest that StI Pro 80 could be involved in step after that of membrane initial binding and prior to the functional pore formation. Keywords: cytolysins, fluorescence, circular dichroism, pore-forming protein, membrane permeability, Cys mutants