Estudo citoquimico, imunocitoquimico e de analise de imagem de celulas fibroblasticas em proliferação e apoptose na ausencia e presença de colageno tipo I hiperpolimerizado

o presente trabalho e composto de dois estudos, o primeiro que trata a respeito da analise da morte celular por apoptose em celulas fibroblasticasem culturas confluentes e o segundo, sobre a influenciado substrato a base de colageno tipo I hiperpolimerizado no crescimento e apoptose de celulas fibroblasticascultivadas por longo periodo. As celulas BHK21 em apoptose, submetidas a reacao de Feulgen e a seguir a analise de imagem, demonstraram menor conteudo de DNA, representado pela diminuicao dos valores de IOD (densidade optica integrada). Apos a reacao de ConcanavalinaA (Com A), os nucleos apoptoticos exibiram uma maior positividade de reacao que os nucleos normais, o que demonstra a presenca de glicoproteinas, possivelmente da matriz nuclear, rearranjadas e complexadas ao DNA do nucleo apoptotico. O arranjo ordenado da complexacao de glicoproteinas ao DNA foi confirmado atraves de coloracao com ATCEC (azul de toluidina-concentracao critica de eletrolitos), a qual diferencia DNA de RNA, seguida por observacao em microscopia de polarizacao. Celulas fibroblasticasV79, submetidas a reacao de Feulgen e estudadas por analise de imagem, mostraram em culturas confluentes tres fenotipos diferentes classificados como normal, suspeito de apoptose e apoptotico. Tal classificacao foi feita aliando analise morfologica e avaliacao de parâmetros como conteudo de DNA (IOD), condensacao cromatinica em termos de densidade optica e medidas de area nuclear. Nossos resultados revelaram que a condensacao cromatinica aumentou quando comparados os tres fenotipos entre si. Foi observado decrescimo nos valores Feulgen-DNA em celulas apoptoticas e em celulas suspeitas de apoptose, revelando-se perda de DNA. Em conclusao, destacou-se a importância do metodo utilizado para caracterizar fases iniciaisdo processo apoptotico e a possibilidade de diagnostico inequivoco de apoptose, ao utilizar esta metodologia, desde que associada a outras, quer citoquimicas, imunocitoquimicasou bioquimicas. No ultimo estudo, celulas fibroblasticas V79 foram cultivadas em substrato de colageno tipo I hiperpolimerizado. Este substrato apresenta caracteristicas especiais de auto-agregacao e e uma estrutura ordenada que mimetiza a estrutura apresentada pelos tendoes in vivo. O cultivo celular de longa duracao sobre este substrato foi caracterizado por analise de proliferacao, diferenciacao e morte celular por apoptose, comparado ao crescimento das celulas sobre laminulas. A reacao de Feulgen, associada a analise de imagem demonstrou que as celulas apresentaram um aumento no conteudo de DNA e da condensacao cromatinica quando crescidas em substrato colagenico. A proliferacao das celulas V79 sobre colageno foi menor, refletindo uma fase de latencia neste substrato e apos o metodo de TUNEL, especifico para deteccao de apoptose, observou-se que a morte celular ocorria, porem em tempos de cultivo superiores aqueles observados para celulas que cresceram sobre laminula. Demonstrou-se que o substrato colagenico altera o desenvolvimento proliferativo e metabolico dos fibroblastos, caracteristicas que sugerem a diferenciacao celular, e tambem atrasa, mas nao previne o processo apoptotico Abstract