Étude structurale et fonctionnelle des modifications post-traductionnelles du domaine ACP dans les polykétides synthases mycobactériennes de type I

Les mycobacteries pathogenes representent toujours des menaces majeures pour la sante humaine. Parmi celles-ci, on trouve Mycobacterium tuberculosis, l'agent etiologique de la tuberculose, l'une des maladies les plus dangereuses de l'histoire humaine. D'autre part, Mycobacterium abscessus est de plus en plus redoutee en raison des maladies pulmonaires qu'elle cause, en particulier chez les hotes vulnerables comme les patients atteints de mucoviscidose. Les polyketides synthases (PKS) participent a la biosynthese de divers lipides complexes de l'enveloppe cellulaire des mycobacteries, qui constitue la premiere ligne de defense contre les molecules toxiques de l'hote. Pour etre catalytiquement actives, les PKS doivent etre actives post-traductionnellement par les 4'-phosphopantetheinyl transferases (PPTases). Les PPTases transferent le bras phosphopantetheinyl (Ppant) du coenzyme A (CoA) sur un residu serine conserve des domaines "acyl carrier protein " (ACP) des PKSs. Une fois active, ce domaine ACP transfere les produits intermediaires attaches a l'extremite du bras Ppant a d'autres domaines catalytiques des PKSs. La caracterisation des interactions entre le domaine ACP et ses partenaires, comprenant les PPTases et les autres domaines d'une meme PKSs, est essentielle pour comprendre les relations structure-fonction de cette importante classe de megasynthases. Dans un premier projet, nous avons choisi de caracteriser biochimiquement et structuralement PptAb, la PPTase de M. abscessus, qui est une cible prometteuse pour traiter les patients atteints de mucoviscidose. Nous avons obtenu des cristaux de PptAb dans diverses conditions, a pH acide et physiologique. Nous avons observe un effet du pH sur la liaison des cofacteurs. De plus, nous avons caracterise l'effet des ions metalliques sur PptAb et constate que les ions Mn2+ ont un effet positif sur la stabilite de la proteine alors que la reaction de transfert in vitro est plus rapide en presence d'ions Mg2+. Enfin, nous avons determine la structure cristallographique du complexe entre PptAb et le domaine ACP de la PKS PpsC de M. tuberculosis, revelant un instantane du transfert du bras Ppant. En outre, les experiences de RMN realisees sur le domaine ACP ont revele une certaine flexibilite au niveau des regions engagees dans les interactions avec PptAb. Dans le deuxieme projet, nous avons voulu etudier les interactions du domaine ACP de PpsC avec les domaines acyltransferase (AT) et deshydratase (DH) de cette PKS. Afin de pieger les complexes correspondants, nous avons utilise deux strategies. La premiere d'entre elles reposait sur la co-cristallisation des domaines DH et ACP, la serine conservee de ce dernier etant covalemment liee a des analogues de substrat. En second lieu, nous avons utilise des agents de pontage fonctionnels pour pieger un complexe stable entre les domaines ACP et AT. Malheureusement, aucune de ces approches methodologiques n'a ete couronnee de succes. En conclusion, cette these de doctorat a contribue a la meilleure comprehension des interactions entre le domaine ACP et ses domaines partenaires des PKS. L'information sur l'enzyme PptAb elle-meme et son interaction avec le domaine ACP devrait etre un element important pour la conception rationnelle de medicaments et, par consequent, pour le developpement d'alternatives therapeutiques pour traiter les patients atteints de mucoviscidose. Nos tentatives de piegeage de complexes ACP-AT et ACP-DH devraient permettre d'elaborer de nouvelles strategies d'etude de la reconnaissance entre l'ACP et ses domaines partenaires.