Proteolízis az idegrendszerben: a humán agyi tripszin szerkezetének és funkciójának vizsgálata = Proteolysis in central nervous system: investigations of the structure and function of human brain trypsin

Klonoztunk a human tripszinogen 4 teljes kodolo szekvenciajat. Bakteralis expresszios rendszerben kifejeztuk a ket alternativ iniciacioval keletkező izoformajat. Expresszaltuk es enzimatikusan karakterizaltuk az a tripszin 4-et. Meghataroztuk az aktiv enzim benzamidin komplexenek terszerkezetet. Felterkepeztuk a mRNS es a feherje eloszlasat a human agy 17 kulonboző regiojaban. Vizsgaltuk az agyban előfordulo potencialis szubsztratjait. Megallapitottuk, hogy szamos, a citoszkeletalis vaz felepiteseben es regulalasaban szereplő feherje es a mielin bazikus feherje szubsztratja lehet a tripszin 4-nek. Izolaltuk a tripszinogen 4-et emberi agyszovetből es meghataroztuk amino terminalis szekvenciajat. Tranziens szovettenyeszetben megfelelően tervezett expresszios vektorok segitsegevel megallapitottuk, hogy az amino terminalis leucin beepuleset nem-konvencionalis CTG iniciator kodon iranyitja. Meghataroztuk a tripszin - metilubellireril guanidinobenzoattal tortenő reakciojanak elemi sebessegi allandoit. Vizsgaltuk szamos termeszetes es szintetikus inhibitor gatlo kepesseget, es valoszinű magyarazatot adtunk arra, miert lehetetlen kanonikus mechanizmus alapjan gatolni a tripszin 4-et. | We have isolated the complete coding sequence of human trypsinogen 4. In bacterial expression system we expressed and purified the two putative isoforms of the enzyme. We isolated the active enzyme as well, and characterized its enzymatic properties. We determined the X-ray structure of the trypsin 4 ? benzamidine complex. By quantitative real time PCR and sandwich ELISA we determined the determined the distribution of the mRNA and protein in 17 different regions of the human brain. By sequencing the zymogen isolated from human brain we concluded that predominant form in the human brain possesses leucine amino terminus. Using human tissue cultures transiently transfected with appropriately designed expression vectors we proved that the incorporation of the amino terminal leucine is directed by a non-conventional CTG initiation codon. We determined the elementary kinetic constants of the trypsin 4 - methylumbelliferyl guanidine benzoate reaction. We studied the inhibitory potential of several natural and synthetic polypeptides, and we reasoned why is it impossible to inhibit trypsin 4 by a canonical inhibitor.