Funktionelle Charakterisierung des essentiellen Tegumentproteins pUL36 des Pseudorabies Virus

Das Pseudorabies Virus ist der Erreger der Aujeszkyschen Erkrankung, einer fieberhaften Allgemeinerkrankung mit neurologischen Symptomen beim Schwein. Aufgrund seiner biologischen Eigenschaften und unkomplizierten Kultivierung in Zellkultur sowie der Verfugbarkeit eines Mausmodells hat sich PrV als geeignetes Modellsystem zur Untersuchung der alphaherpesviralen Replikation etabliert. Das Tegument stellt den komplexesten und noch am wenigsten verstandenen Teil des Herpesviruspartikels dar. Fur PrV konnten mehr als 15 dem Tegument zugeordnete Proteine identifiziert werden, die neben ihrer strukturellen Bedeutung auch regulatorische Funktionen erfullen.Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung funktioneller Domanen des essentiellen Tegumentproteins pUL36 des Pseudorabies Virus. Mit Hilfe eines Transkomplementationsassays konnten verschiedene rekombinante UL36-Proteine auf ihre Fahigkeit, den letalen Replikationsdefekt einer UL36-Deletionsmutante zu komplementieren, uberpruft werden. Bei positiver Komplementation wurden stabile Virusrekombinanten isoliert und diese auf ein moglicherweise verandertes Replikationsverhalten in der Zellkultur (in vitro) oder im Mausmodell (in vivo) untersucht. Negative Komplementationsergebnisse weisen auf eine essentielle Funktion dieser Region innerhalb des UL36-Proteins hin. Die durchgefuhrten Primarsequenzvergleiche homologer UL36-Proteine zeigten einen geringen Grad an Sequenzhomologie. Jedoch konnten mehrere konservierte Domanen und putative Motive identifiziert werden. Dem im N-Terminus gelegenen Modul konnte die fur HSV-1 sowie Vertretern aller drei Unterfamilien beschriebene Deubiquitinylierungsaktivitat zugeordnet werden. Weiterhin zeigte sich, dass die 62 C-terminalen Aminosauren innerhalb der Alphaherpesviren stark konserviert sind, was auf eine wichtige Bedeutung dieser Region fur die Funktion des UL36-Proteins hindeutet. Eine grose prolinreiche Domane im C-terminalen Bereich spricht fur eine extreme Flexibilitat des Proteins und eine mogliche Konformationsanderung wahrend des Replikationszykluses. Leucin-Zipper-Motive konnten eine pUL36-Homodimerisierung oder eine bisher noch nicht beschriebene Interaktion mit viralen oder zellularen Proteinen vermitteln. Nach Charakterisierung verschiedener rekombinanter UL36 Proteine lasst sich Folgendes zum essentiellen Tegumentprotein pUL36 des Pseudorabies Virus sagen: 1) Es konnten verschiedene Domanen innerhalb des PrV-UL36-Proteins identifiziert werden, die fur die Replikation sowohl in der Zellkultur als auch im Tiermodell von unterschiedlich wichtiger Bedeutung sind. Insgesamt wurden fast 50% des Proteins deletiert, ohne einen letalen Funktionsverlust zu bewirken. 2) Der C-Terminus des UL36-Proteins des Pseudorabies Virus ist fur die Funktion des Proteins im Replikationsgeschehen essentiell, was auf eine mogliche Interaktion mit Kapsid- und/oder kapsidassoziierten Proteinen zuruckzufuhren sein konnte. 3) Die reifen Virionen der Mutanten zeigen keine Veranderungen hinsichtlich ihrer Morphologie. Auch biochemisch wurden keine Veranderungen in der Proteinzusammensetzung der untersuchten Virionen festgestellt. 4) Keine der charakterisierten Mutanten wies einen Defekt bei der Freisetzung neugebildeter Kapside aus dem Zellkern auf, d.h., die deletierten Bereiche haben keine Bedeutung wahrend der nuklearen Phasen der Virusmorphogenese. 5) PrV-pUL36 konnte weiterhin fur den Ablauf der Infektion des Nervensystems von Bedeutung sein, da eine deutliche Einschrankung der Neuroinvasion einiger Mutanten im Mausmodell beobachtet wurde.