Use of PCR for detection of bovine tuberculosis bacillus in milk of positive skin test cows

The causative agent of bovine tuberculosis (BTB) is Mycobacterium bovis, a bacterium belonging to the M. tuberculosiscomplex (MTC). The definitive diagnosis is achieved through isolation and identification of M. bovis from clinical samples, using a combination of traditional culture and biochemical methods, which is considered the “gold standard”. This procedure is cumbersome and time-consuming. We evaluated a PCR assay for the direct detection of MTC DNA in milk of positive skin test cows, using primers that were previously tested and proven reliable to target the IS6110element. Milk previously seeded with M. bovis was used as the starting material, for standardization of the technique. The procedure involved extracting the DNA by enzymatic lysis (proteinase K and lysozyme), phenol, chloroform, isoamyl alcohol, followed by ethanol precipitation and PCR. The PCR assay allowed us to detect BTB in artificially contaminated milk, with a detection limit of 100 CFU/mL, and was also able to detect the bacillus in 50% (75/150) of the milk samples tested. This procedure could be used to assist the in vivo diagnosis of BTB, complementing sorological or microbiological tests, becoming an alternative option for epidemiological studies of BTB transmission and preventing contaminated milk from entering the food supply. O agente causador da tuberculose bovina (BTB) e o Mycobacterium bovis, uma bacteria pertencente ao complexo M. tuberculosis (CMT). O diagnostico definitivo e realizado atraves do isolamento e identificacao de M. bovis em amostras clinicas, utilizando uma combinacao de cultura bacteriologica e metodos bioquimicos, que sao considerados como “padrao de ouro”. Entretanto, esses procedimentos sao trabalhosos e demorados. No presente estudo, foi avaliado um ensaio de PCR para a deteccao direta de DNA de CMT em leite de vacas positivas ao teste cutâneo, utilizando primerspreviamente testados e comprovadamente confiaveis, para amplificacao da regiao de interesse IS6110. Leite previamen- te contaminado com M. bovis foi utilizado como material de partida para a padronizacao da tecnica. O procedimento envolveu a extracao do DNA por lise enzimatica (proteinase K e lisozima), fenol, cloroformio, alcool isoamilico, segui- do de precipitacao com etanol e PCR. O ensaio de PCR detectou BTB em leite artificialmente contaminado, com um limite de deteccao de 100 UFC/mL, e tambem foi capaz de detectar o bacilo em 50% (75/150) das amostras de leite testadas. A tecnica de PCR pode ser utilizada para auxiliar o diagnostico in vivo da BTB, alem de complementar os tes- tes sorologicos ou microbiologicos, tornando-se uma alternativa para estudos epidemiologicos da transmissao de BTB, prevenindo que o leite contaminado entre na cadeia de alimentos.