致病疫霉 NLP 家族基因 PiNLP30的克隆、原核表达及蛋白质纯化

为了制备致病疫霉 NLP 家族中 PiNLP30蛋白的多克隆抗体，根据 GenBank 中 PiNLP30的cDNA 序列及原核表达载体 pET28b 中的多克隆位点设计引物，对 PiNLP30基因进行 RT PCR 扩增和重组质粒 pET28b PiNLP30的构建，将重组质粒在大肠杆菌 BL21（DE3）表达体系中进行诱导表达，通过 SDS PAGE 检测蛋白质表达，并利用镍琼脂糖亲和层析进行蛋白质纯化。克隆和序列分析显示，该基因 cDNA 全长714 bp，编码237个氨基酸。该基因编码蛋白质是一个主要由不规则卷曲组成的亲水蛋白，含有一段19个氨基酸的信号肽序列。预测蛋白质分子量为26.6 kD，等电点5.49。经PCR、酶切及测序验证，成功构建了原核表达载体 pET28b PiNLP30，使用0.6 mmol/L IPTG 于37℃下诱导6 h 后蛋白质大量表达，表达的蛋白质主要以包涵体形式存在。经镍琼脂糖亲和层析进行纯化，获得了纯化的 PiNLP30蛋白，其质量浓度约为0.3 mg/mL。