Aislamiento y caracterización del gen de la transglutaminasa de arroz (Oryza sativa)

En esta tesis se describen los resultados obtenidos en la clonacion y caracterizacion de una nueva transglutaminasa (TGasa) vegetal aislada en arroz (Oryza sativa), la segunda transglutaminasa clonada en plantas y la primera en plantas C3. Las TGasas (E.C.2.3.2.13) son una familia de enzimas que promueven modificaciones postraduccionales de proteinas. Tienen especial importancia debido a sus implicaciones en enfermedades humanas y a sus aplicaciones biotecnologicas de interes industrial. Su investigacion en plantas es aun incipiente y solo se ha clonado hasta la fecha la TGasa cloroplastica de maiz (TGZ), a partir de una libreria de ADNc. El aislamiento de la nueva transglutaminasa de arroz, descrita en esta tesis, se ha realizado a partir de ADN copia y genomico. Utilizando cebadores diferenciales se realizo la clonacion del gen (tgo), su insercion en un vector de expresion y su caracterizacion. Los analisis de la secuencia de tgo han permitido deducir que este nuevo gen esta constituido por una secuencia de 1605 pb y que codifica para una proteina (TGO) de 352 aminoacidos. El analisis de la secuencia de TGO ha permitido detectar diferentes dominios relacionados con la actividad TGasa, como son la triada catalitica (Cys-His- Asp), secuencias repetidas en tandem y varios sitios de N-miristoilacion. Ademas, otros dominios detectados, como los leucine-zipper, no eran conocidos en TGasas vegetales. La expresion de la proteina TGO en E. coli ha permitido realizar la caracterizacion de la enzima con respecto a diferentes parametros. Asi, mediante ensayos de actividad se ha podido confirmar la preferencia de la enzima frente a diferentes sustratos, asi como su dependencia de calcio y la inhibicion de su actividad frente a conocidos inhibidores de la actividad TGasa. Igualmente, la enzima fue capaz de polimerizar un sustrato in vitro y se comprobo su dependencia de la luz utilizando proteinas tilacoidales como sustrato. Estas y otras caracteristicas relevantes han permitido identificar a esta enzima como una verdadera TGasa. Finalmente, ensayos realizados con plantas de arroz para determinar su localizacion subcelular, asi como su relacion con proteinas implicadas en la fotosintesis y su dependencia de la luz, llevan a sugerir que las funciones de TGO estan asociadas a procesos fotosinteticos, probablemente relacionados con fotoproteccion, al igual que ya se habia descrito para la TGasa de maiz, aunque no se descartan otras funciones relacionadas.