Análise estatística da frequência de micronúcleos em diferentes doses absorvidas de raios gama

Introducao Ao atuarem sobre o sistema biologico, as radiacoes ionizantes alteram o material genetico, seja de forma direta, seja de forma indireta atraves da formacao de radicais livres que quebram a fita de DNA (LEMES, 1997). Para a biodosimetria, essas alteracoes fornecem uma medida do dano e, com isso, tornam-se uma resposta biologica muito sensivel a dose absorvida de radiacao. A tecnica de micronucleos (MN) com bloqueio da citocinese celular (CBMN - Cytokinesis-Block Micronucleus) e capaz de identificar essas alteracoes cromossomicas (THIERENS & VRAL, 2009). Os MN sao pequenas massas nucleares, revestida por membrana, dispersos no citoplasma linfocitario, separados do nucleo principal. Sua quantidade varia, em relacao a dose absorvida pelo individuo (FERNANDES, 2005). No caso de acidentes radiologicos em grande escala, estudos realizados por Alexander et al (2007) mostraram real potencial para utilizacao da tecnica de MN em triagem. A frequencia de MN encontradas em linfocitos circulantes e convertida em dose absorvida atraves do uso de curvas de calibracao dose-resposta previamente estabelecidas pelo proprio laboratorio. Cada ponto da curva de calibracao representa uma media da dose absorvida pelos linfocitos irradiados. Isso e aproximado para uma media de dose absorvida de corpo inteiro considerando que os linfocitos sao amplamente moveis e distribuidos pelo corpo. Uma vez a curva gerada e estabelecida, e possivel estimar a dose absorvida pelo organismo do individuo exposto a radiacao ionizante (AINSBURY & LLOYD, 2010; ROY et al., 2012). Assim este trabalho propoe a analise estatistica das frequencias de observadas em pontos que farao parte da curva de calibracao dose-resposta de MN para radiacao gama do Laboratorio de Dosimetria Biologica do Centro Regional de Ciencias Nucleares do Nordeste (CRCN/NE). Metodologia A pesquisa foi realizada no Laboratorio de Dosimetria Biologica do Centro Regional de Ciencias Nucleares do Nordeste – CRCN-NE, e faz parte de um projeto aprovado para coleta de dados pelo Comite de Etica envolvendo pesquisas com seres humanos da Universidade Federal de Pernambuco. Um voluntario saudavel foi selecionado apos anamnese, e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Foram coletadas amostras de sangue periferico (10 ml), por coleta de sangue a vacuo. Cada amostra de sangue foi separada em duas aliquotas de 5 ml, sendo uma considerada controle (nao irradiada) e mantida a temperatura ambiente do laboratorio (20 - 22 oC), e a outra aliquota, considerada amostra irradiada, exposta a uma fonte de 60 Co (irradiador Gammacel 220) localizada no Departamento de Energia Nuclear (DEN-UFPE) (temperatura da sala de ~22 oC). As amostras foram irradiadas em Kerma no ar e os valores foram convertidos em dose absorvida -atraves da multiplicacao do valor de KERMA no ar por 1,10- a fim de que resulte nas amostras valores de doses de 0,15 a 1,5Gy. Apos a irradiacao as amostras passaram duas horas em estufa de CO2 para reparacao das celulas, depois seguiram para a cultura de linfocitos, seguindo as normas descritas no manual da AIEA (2011). O precipitado de celulas obtido dessa cultura foi ressuspenso e delicadamente gotejado em um ponto na lâmina e colocada para secar a temperatura ambiente durante 24h. Em seguida, as lâminas foram coradas com Giemsa a 5% durante 7 min para posterior analise cromossomica. A contagem de micronucleos foi realizada diretamente no microscopio optico (Leica DM 500). E, ao menos, 2000 celulas binucleadas viaveis foram contadas. Os criterios estabelecidos por FENECH (2007) e pela IAEA (2011) foram seguidos a fim de considerar uma celula binucleada como viavel. Ao termino da contagem das celulas foram realizados calculos estatisticos. Como os metodos de ajuste de curva se baseiam em modelos estatisticos de Poisson, se deve verificar se a distribuicao de celulas com MN se ajustam ou nao a distribuicao de Poisson para cada dose utilizada para compor a curva de calibracao por meio do teste u de Papworth (AIEA, 2011; ACHARYA; et. al., 2009). A estatistica de teste u e uma unidade normalizada do indice de dispersao (σ 2 / y) onde valores de u superiores a 1,96 indicam sobredispersao significativa e os valores de u <-1,96 indicam a subdispersao significativa (AIEA, 2011). Resultados Foram analisadas 18070 celulas binucleadas viaveis. A frequencia de MN para a amostra controle (background), conforme observa-se na Tabela 1, esta de acordo com o que ja foi relatado na literatura, que e uma faixa de frequencia entre 0 a 40 MN por 1000 celulas binucleadas. Foi possivel observar a relacao entre a dose absorvida e a frequencia de MN, confirmando que, com o aumento da dose absorvida, a frequencia de MN tambem aumenta. Esse crescimento demonstrou uma dependencia linear do rendimento de MN com a dose. Alem disso, com o aumento da dose e possivel observar a presenca de celulas binucleadas com mais de um MN. Nas doses de 0,15 e 0,5 Gy, nota-se um crescicmento na frequencia de micronucleos, sendo observados, ainda em sua maioria 1 por celula. Ao contrario do que e mostrado nas doses de o,75 e 1,5 Gy, no qual a quantidade de micronucleos torna-se aumentada, com aparecimento de dois micronucleos em uma unica celula. Na analise estatistica do teste u observou-se sobredispersao na maioria das doses testadas de micronucleos neste trabalho, seguindo os modelos ja encontrados na literatura, sendo entao o resultado esperado. TABELA 1. Verificacao da frequencia e distribuicao celular de micronucleos. Total MN Freq 0MN 1MN 2MN media SE media var/med SE Var/Med U 0* 6000 19 0,003 5982 17 1 0,003 0,001 1,1 0,018 5,76 0.15 2000 40 0,020 1961 38 1 0,02 0,003 1,03 0,031 0,977 0.5 2000 94 0,047 1911 84 5 0,047 0,005 1,06 0,031 1,9 0.75 4070 283 0,070 3805 247 18 0,07 0,004 1,06 0,022 2,62 1.5 4000 482 0,121 3554 410 36 0,12 0,005 1,03 0,022 1,3 * referente ao sangue controle, (MN) Numero de micronucleos, (freq) frequencia, (SE media) desvio padrao da media, (var/med) indice de dispersao, (SE Var/Med) desvio padrao do indice de dispersao, (U) teste u. Conclusao As frequencias de micronucleo relacionadas as doses absorvidas estudadas serao utilizadas na curva de calibracao dose-resposta de MN para radiacao gama do Laboratorio de Dosimetria Biologica do CRCN/NE. A curva sera complementada ate a dose absorvida de 5Gy. Referencias: ANTUNES, A. C., MARTINS, V., CARDOSO, J., SANTOS, L., and MONTEIRO,G.O., The cytokinesis-blocked micronucleus assay: Dose estimation, and inter-individual differences in the response to γ-radiation. Mutation Research, 760:17–22, 2014. International Atomic Energy Agency, IAEA Cytogenetic dosimetry: applications inpreparedness for, and response to radiation emergencies. EPR-Biodosimetry,2011. KoKSAL G, DALCI DO, and PALA FS. Micronuclei in human lymphocytes: theCo-60 gamma-ray dose-response. Mutation Research/Environmental Mutagenesisand Related Subjects, 359(2):151-157, 1996. THIERENS, H., VRAL, A. The micronucleus assay in radiation accidents. AnnaliDell Istituto Superiore Di Sanita, 45(3):260-264, 2009. VENKATACHALAM, P., SOLOMON, F. P., PRABHU, B. K., MOHANKUMAR, M. N.,GAJENDIRAN, N., and JEEVANRAM, R. K. Estimation of dose in cancer patientstreated with fractionated radiotherapy using translocation, dicentrics andmicronuclei frequency in peripheral blood lymphocytes. MutationResearch/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 429(1):1-12,1999. VRAL A., CORNELISSEN M., THIERENS H., LOUAGIE H., PHILIPPE J.,STRIJCKMANS K., and DE RIDDER, L., Apoptosis induced by fast neutronsversus 60Co gamma-rays in human peripheral blood lymphocytes. Int J Radiat Biol, 73:289–95, 1998. VRAL A, FENECH M, and THIERENS H The micronucleus assay as a biological dosimeter of in vivo ionising radiation exposure. Mutagenesis, 26(1):11-17, 2011.