布鲁杆菌M5-90△bp26基因缺失株的构建与免疫原性的比较研究

目的构建布鲁杆菌M5-90△bp26基因缺失株，对比观察其免疫原性与M5—90亲本株的区别，研制毒力弱、安全性能好并能进行鉴别诊断的布鲁杆菌弱毒候选苗。方法利用常规分子生物学技术构建布鲁杆菌M5-90△bp26基因缺失株并进行遗传稳定性检测和常规细菌学性质鉴定；用1．0×10^9CFU／2Inl剂量的M5—90亲本株和M5-90△bp26基因缺失株分别免疫绵羊，所得血清与纯化的BP26蛋白进行Westernblot免疫印迹实验，比较M5—90Abp26基因缺失株与M5—90亲本株在体液免疫中对BP26蛋白识别上的差异；用试管凝集试验（SAT）检测受试绵羊不同时期（0、7、14、21、30、45d）的血清效价；安全性试验用1．0×10^6、6．0×10^6、2．0×10^7CFU／O．2ml的M5-90亲本株和M5-90△bp26基因缺失株分别免疫接种小鼠，观察、记录小鼠接种疫苗后的临床症状和死亡情况，比较二者的毒力。结果遗传稳定性检测M5—90亲本株PCR扩增出长度约1279bp的片段，而2—15代的M5-90△bp26基因缺失株扩增出长度约629bp的片段，后者测序结果表明出现bp26基因650bp的缺失；常规细菌学性质鉴定结果，M5-90△bp26由M5—90亲本株的单因子血清试验M型转变为R型，BK2噬菌体裂解实验由阳性转变为阴性，鉴定为深度变异菌株；Westernblot免疫印迹实验表明M5—90△bp26基因缺失株免疫绵羊所获得的血清与纯化的BP26蛋白不发生反应，而M5—90亲本株可发生反应；STA试验表明M5-90△bp26基因缺失株诱导绵羊产生抗体水平（1：50）明显低于M5—90亲本株（〉1：800）；安全性试验表明M5-90△bp26基因缺失株毒力比M5—90亲本株明显减弱。结论成功构建M5-90△bp26基因缺失株。与M5-90亲本株比较，M5-90△bp26基因缺失株具有毒力弱、能区分自然感染与疫苗免疫的特点，可作为标记疫苗的候选株。