Análisis de beta-glucosidasa en sangre seca recolectada en papel filtro (DBS), reporte de un nuevo método aplicado a población control y pacientes con sospecha de enfermedad de Gaucher

espanolLa enfermedad de Gaucher (GD) es el trastorno de almacenamiento lisosomal que se caracteriza por la deficiencia en la actividad enzimatica de la β-glucosidasa (BGLU), lo que produce la acumulacion de glucosilceramida en las celulas. Su diagnostico se orienta a la valoracion de la enzima en los leucocitos afectados. Se han realizado estudios en DBS para la actividad de BGLU en el seguimiento de poblaciones de alto riesgo; sin embargo, presentan interferencias relacionadas a leucopenias severas o expresion aumentada de la isoforma neutra de la enzima BGLU, molecula no relacionada con GD. El objetivo de este estudio fue la estandarizacion de un metodo de tamizaje en DBS (punch: 5 mm) con el uso de 4-metilumbeliferil-β-D-glucosido y conduritol-β-epoxido. Se analizaron muestras de dbs de 395 individuos con sospecha clinica (poblacion de alto riesgo o AR), 151 controles y 16 pacientes afectados, usando la elucion de un corte de 5 mm (≈10 μl de sangre) en 300 μl de Triton X-100/(0,5 %). Como resultados, se obtuvieron los rangos, AR: 0,84-26,92 nmol/ml/h, controles: 3,56- 8,92 nmol/ml/h (M = 5,56, ds = 1,15) y pacientes confirmados con GD: 0,82- 2,88 nmol/ml/h (M = 1,64, ds = 0,57). El punto de corte entre deficientes y controles fue 3,22 nmol/ml/h, obtenido a partir de analisis ROC (99 % confianza, 100 % sensibilidad y 100 % especificidad). El protocolo permitio evidenciar la deficiencia en todos los casos de GD, confirmados mediante el analisis en paralelo de la enzima en aislamiento leucocitario. Se recomienda el uso del CBE y realizar la elucion del corte a 5 mm, a fin de llevar a cabo la valoracion enzimatica con un volumen mayor aproximado de sangre y en ausencia de la actividad generada por la isoforma neutra. EnglishGaucher disease (GD) is a lysosomal storage disorder characterized by a deficiency in the enzymatic activity of β-glucosidase (BGLU), resulting in the accumulation of glucosylceramide in cells. Its diagnosis is aimed at checking the enzyme in the affected leukocytes. Studies have been conducted on dried blood spots (DBS) for BGLU activity to monitor high-risk populations; however, they exhibit interferences related to severe leukopenias or increased expression of the neutral BGLU isoform, a molecule not related to GD. This study intends to standardize a screening method on DBS (punch: 5 mm) using 4-methylumbelliferyl-β-D-glucopyranoside and chonduritol-β-epoxide. DBS samples from 395 individuals clinically suspected of GD (high-risk or HR population), 151 controls, and 16 affected patients were analyzed using the elution of 5 mm punches (≈10 μl of blood) in 300 μl of Triton X-100/ (0.5 %). As a result, the following ranges were obtained; hr: 0.84-26.92 nmol/ml/h, controls: 3.56-8.92 nmol/ml/h (M = 5.56, sd = 1.15), and patients with confirmed gd: 0.82-2.88 nmol/ml/h (M = 1.64, sd = 0.57). The cut-off point between patients with GD and controls was 3.22 nmol/ml/h, obtained from ROC analysis (99 % ci, 100 % sensitivity, and 100 % specificity). The protocol revealed a deficiency in all GD cases, confirmed by parallel BGLU analysis in isolated leukocytes. The use of CBE and the elution of 5 mm punches are recommended for enzymatic titration with a larger approximate volume of blood in the absence of neutral isoform activity. portuguesA doenca de Gaucher (GD) e o trastorno de armazenamento lisosomal caracterizado pela deficiencia na atividade enzimatica da β-glucosidase (BGLU), o que produz a acumulacao de glucossilceramida nas celulas. Seu diagnostico esta orientado a avaliacao da enzima nos leucocitos afetados. Foram realizados estudos em DBS para a atividade de BGLU no seguimento de populacoes de alto risco; contudo, sao apresentadas interferencias relacionadas a leucopenias graves ou a expressao aumentada da isoforma neutra da enzima BGLU, molecula nao relacionada com GD. O objetivo deste estudo foi a padronizacao de um metodo de tamisacao em DBS (punch: 5 mm) com o uso de 4-metilumbeliferil-β-D- glicosideo e conduritol-β-epoxido. Foram analisadas amostras de dbs de 395 individuos com suspeita clinica (populacao de alto risco ou AR), 151 controles e 16 pacientes afetados, usando a eluicao de um corte de 5 mm (≈10 μl de sangue) em 300 μl de Tritao X-100/(0,5 %). Como resultados, foram obtidos os intervalos: AR: 0,84-26,92 nmol/ml/h, controles: 3,56-8,92 nmol/ml/h (M = 5,56, ds = 1,15) e pacientes confirmados com GD: 0,82- 2,88 nmol/ml/h (M = 1,64, ds = 0,57). O ponto de corte entre deficientes e controles foi 3,22 nmol/ml/h, obtido a partir de analise ROC (99 % confianca, 100 % sensibilidade e 100 % especificidade). O protocolo permitiu evidenciar a deficiencia em todos os casos de GD, confirmados mediante a analise em paralelo da enzima em isolamento leucocitario. E recomendado o uso do CBE e a realizacao da eluicao do corte a 5 mm, a fim de implementar a avaliacao enzimatica com um volume maior aproximado de sangue e em ausencia da atividade gerada pela isoforma neutra.