Identifizierung und Charakterisierung einer tumorentitätspezifisch überexprimierten Protein-Isoform eines bisher unbekannten Gens

Die Progression von benignen Neoplasien zu malignen Tumoren wird von spezifischen Veranderungen des Genexpressionsmusters begleitet. Die Analyse der differentiellen Genexpression kann daher der Aufklarung der molekularen Mechanismen in der Pathogenese eines Tumors dienen. Zudem konnen tumorspezifisch uberexprimierte Gene in der Krebsdiagnostik eine Anwendung als molekulare Marker finden, indem sie karzinogene Zellen nachweisen. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei alternative Methoden, die Hybridisierung von Protein-Arrays und die in-silico-Analyse von EST-Datenbanken, eingesetzt, mit denen es moglich war potentiell tumorassoziierte Kandidaten-Gene zu identifizieren. Sechs der gefundenen Kandidaten-Gene konnten durch die Anwendung der Real-Time-PCR-Technik als differentiell regulierte Gene im Kolon- oder Lungenkarzinom nachgewiesen werden. Bis auf ein identifiziertes uberexprimiertes Gen (GRPR), sind fur die Gene bisher weder eine Funktion noch eine differentielle Expression detektiert worden. Aufgrund der signifikanten Uberexpression in Lungen-Adenokarzinomen wurde das unbekannte Gen EST 5364 fur eine nahere Charakterisierung ausgewahlt und mit LUMA (Lung Marker) benannt. Die vorliegende Arbeit charakterisiert das Gen LUMA auf molekularbiologischer und die Genprodukte auf Protein-Ebene. Die vollstandige Lange des LUMA-Transkriptes konnte durch eine „full-length“-Klonierung isoliert werden und korrelierte mit der in einer Northern Blot Analyse detektierten Transkript-Grose. Anhand von Sequenzierungen konnte eine komplexe Vielfalt von alternativen LUMA-Spleis-Varianten identifiziert werden, die zu drei verschiedenen Carboxy-terminalen Protein-Isoformen fuhren. Zu LUMA orthologe, bisher unbekannte Nukleotid- bzw. Aminosauresequenzen wurden in verschiedenen Organismen identifiziert und weisen auf eine evolutionare Konservierung und funktionelle Bedeutung des bisher unbekannten Gens hin. Da keine paralogen Gene ermittelt werden konnten, bestehen derzeit keine Hinweise auf die Zugehorigkeit von LUMA zu einer humanen Genfamilie. Eine computerbasierende Analyse der LUMA-Protein-Isoformen ergab, dass es sich wahrscheinlich um losliche Proteine handelt, die zudem Coiled-Coil-Strukturen aufweisen. Die hydrophobe Aminosaureverteilung im C-Terminus einer Spleis-Variante (LUMA-16A), die durch alternatives Spleisen generiert wird, konnte eine potentielle Transmembran-Domane darstellen. Mit generierten polyklonalen und monoklonalen Antikorpern konnte nachgewiesen werden, dass das transkribierte Gen auch translatiert wird und, dass das LUMA-Protein im Zytoplasma lokalisiert ist. Eine detaillierte RNA-Expressionsstudie an verschiedenen Normalgeweben, Tumor-Zelllinien und Paaren von Lungen Tumor- und Normalgeweben, konnte belegen, dass bestimmte Spleisvarianten sich in ihren Expressionsmustern unterscheiden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass zwei Spleis-Varianten (LUMA-15A, LUMA-15B), die sich durch Sequenzunterschiede im Exon 15 auszeichnen, tumorspezifisch uberexprimiert werden. Eine weitere Spleis-Variante des Exons 15 (LUMA-D15) zeigte hingegen ein ubiquitares Expressionmuster in benignen und karzinogenen Zellen. Die Resultate deuten darauf hin, dass die alternative Prozessierung des Exons 15, von dem drei verschiedenen Formen detektiert wurden, eine zentrale Rolle bei der tumorspezifischen Genexpression von LUMA spielt. In immunhistochemischen Analysen an Lungengeweben konnten die auf RNA-Ebene detektierten Expressionsprofile der Spleis-Varianten auch fur die entsprechenden Protein-Isoformen auf Protein-Ebene bestatigt werden. Durch umfassende immunhistochemische Analysen an Lungengeweben wurde nachgewiesen, dass die Protein-Isoform LUMA-15A in samtlichen analysierten Lungenkarzinom-Subtypen, von NSCL uber SCLC, sowie in Lungemetastasen anderer Tumorentitaten meist stark exprimiert wird. Demgegenuber zeigten Lungen-Normalgewebe und Gewebeproben von nicht karzinogenen Lungenerkrankungen keine oder geringe LUMA-15A-Expressionen. Die Auswertung dieser Ergebnisse in Hinsicht auf einen potentiellen LUMA-Diagnostik-Marker zeigte, dass Werte von 90,9% fur die Sensitivitat und 95,3% fur die Spezifitat erreicht wurden. In immunhistochemischen Analysen konnte zudem eine erhohte Expression von LUMA-15A in Blasenkarzinomen im Vergleich zu Blasen-Normalgeweben nachgewiesen werden. Eine LUMA-15-Expression wurde auch auf zytologischer-Ebene in Zellen aus Bronchialsekreten detektiert. Durch eine Doppelfarbung von LUMA-15A und Ki67 war es in Bronchialsekreten von Lungenkarzinom-Patienten (Plattenepithel- und Adenokarzinom) moglich, maligne Zellen spezifisch zu identifizieren. Eine Expression von LUMA-15A als auch von Ki67 wurde lediglich in Tumorzellen nachgewiesen. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine potentielle pathogenetische Bedeutung von LUMA-Spleis-Varianten bzw. Protein-Isoformen im Bronchial- und Blasenkarzinom hin und bieten moglicherweise die Basis fur die Entwicklung eines Krebs-Diagnostik-Tests.