Caracterização de uma aldo-ceto redutase relacionada a patogenicidade de Xylella fastidiosa

o programa de sequenciamento genomico da bacteria Xylella fastidiosa gerou um enorme numero de ORFs ("Open Reading Frames" - quadro de leitura aberto ou genes putativos) pertencentes as categorias de patogenicidade, virulencia e adaptacao deste importante fitopatogeno. Uma destas ORFs (XF 1729) foi anotada como sendo uma fenilacetaldeido desidrogenase de 31,4 kDa. No entanto, a analise de sua sequencia primaria de aminoacidos revelou similaridades com proteinas pertencentes a superfamilia de aldo-ceto redutases. As proteinas desta superfamilia sao oxidorredutases NADPH-dependentes relacionadas funcionalmente e estruturalmente. Neste trabalho, a sequencia similar de X fastidiosa foi clonada no vetor de expressao pET32Xa/LIC com o objetivo de super expressar a proteina recombinante fusionada a seis residuos de histidina em Escherichia coli BL21(DE3). A proteina expressa na fracao soluvel foi purificada por cromatografia de afinidade em metal imobilizado (resina Agarose-IDA-Ni). O conteudo de sua estrutura secundaria foi verificado por espectroscopia de dicroismo circular. As medidas de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) forneceram os parâmetros estruturais gerais (raio de giro de 27,5 :I: 0,8 A e maxima dimensao de 90 A) e indicaram que a proteina apresenta-se como um monomero em solucao. Alem disto, os calculos estruturais ab initio mostraram que a proteina apresenta algumas similaridades com uma aldo-ceto redutase previamente cristalizada. A proteina XF 1729 purificada foi capaz de catalisar a reducao dos substratos DL-gliceraldeido (Kcat 2.26 S-l, Km 8.20:1: 0.98 mM) e 2-nitrobenzaldeido (Kcat 11.74 S-l, Km 0.14:1: 0.04 mM) na presenca de NADPH. A sequencia de aminoacidos da proteina XFI729 apresentou mais alta identidade (maior que 40%) com inumeras proteinas de funcao desconhecida. Entre as AKRs identificadas, encontramos aproximadamente 29% de identidade com YakC (AKRI3) de Schizosaccharomyces pombe, 30% e 28% com AKRIIA e AKRIIB, ambas de Baci/lus subtiZis, respectivamente. Os resultados estabeleceram a proteina XF 1729 como um novo membro da superfamilia das AKRs, da nova sub-familia AKR13B 1. Finalmente, os experimentos de caracterizacao por cromatografia de gel filtracao indicaram que a proteina apresenta wna forma alongada, gerando wn peso molecular aparente maior que o esperado. Alem da proteina AKRl3B 1, selecionamos mais duas proteinas codificadas pelas ORFs XFl934 e XFl532 para estudos de estrutura e funcao. A proteina HetI (XFI934), de 22,4 kDa, apresenta similaridade proteinas da familia phosphopantetheinyl transferase, sendo necessaria a sintese de acido graxo via acetato na bacteria. A proteina XF1532, de 36,8 kDa, e sirpilar a reguladores transcricionais de extresse oxidativo, sendo sua sequencia similar (44%) a proteina OxyR de Escherichia coZi, a qual pertence a familia LysR de reguladores transcricionais. As duas ORFs foram clonadas e expressas em Escherichia coZi, no entanto nao foi possivel obter a proteina na fracao soluvel, impossibilitando o seguimento dos estudos de caracterizacao estrutural e funcional. A descricao da metodologia utilizada para producao destas proteinas e os resultados preliminares obtidos estao descritos no item Resultados Complementares desta tese. Um amplo beneficio no conhecimento dos mecanismos de patogenicidade da X fastidiosa tem sido esperado, desde o sequenciamento completo de seu genoma. Neste sentido, passos iniciais foram dados no sentido de se caracterizar a funcao das proteinas codificadas por seus genes Abstract