Dosage de l'activité endoprotéolytique de neurotoxines clostridiales

L’utilisation croissante des neurotoxines botuliques comme agents therapeutiques et cosmetiques mais aussi le risque qu’elles constituent en tant qu’armes biologiques potentielles necessitent l’elaboration de nouveaux tests de detection de leur activite proteolytique in vitro, pour remplacer a terme le test de reference de letalite in vivo chez la souris. Un dosage in vitro de l’activite des BoNT/B par resonance plasmonique de surface (SPR, mis au point par Ferracci et al. En 2005, est base sur la quantification directe de la VAMP2, proteine des vesicules synaptiques, par son immuno-capture sur des anticorps specifiques immobilises sur la sensor chip. Ce test est 200 fois plus sensible et jusqu’a 25 fois plus rapide que le test de reference in vivo. Le clivage de la VAMP2 des vesicules synaptiques par la BoNT/B a ete estime par SPR, ELISA et cytometrie de flux. Les EC50 determines sont similaires entre les trois methodes alors que l’analyse SPR est beaucoup plus rapide et economique. D’autre part, les VS constituent un substrat tres robuste, lyophilisable, permettant de detecter l’activite enzymatique de la BoNT/B dans des milieux complexes. L’utilisation d’un protocole d’immunoisolation de la BoNT/B dans le serum rend le test 30 fois plus sensible que la methode in vivo. Nous avons developpe une methode SPR permettant la quantification de proteines de la membrane plasmique et le dosage de l’activite de la BoNT/A. Des antigenes membranaires intracytoplasmiques, dont la SNAP-25 (cible de la BoNT/A), ont ete doses sans solubilisation avec une sensibilite de l’ordre du picogramme. En utilisant un anticorps reconnaissant specifiquement la SNAP-25 clivee par la BoNT/A, nous avons etabli une methode de dosage rapide et sensible de ce serotype. La methode a ete appliquee au dosage de l’activite de la BoNT/A dans des cultures cellulaires en 24 ou 96 puits.