Mise au point d’une méthode d’analyse chromatographique commune à la méthacholine, le béthanéchol et leurs substances apparentées

Introduction Le chlorure de methacholine (MCh) en solution aqueuse a reconstituer extemporanement avec un tampon phosphate et le chlorure de bethanechol (BC) en pilulier sont deux preparations hospitalieres. La MCh permet le diagnostic d’une hyperreactivite bronchique non specifique tandis que le BC sert au traitement du reflux gastro-œsophagien primaire de l’enfant et du nourrisson. Les bonnes pratiques de fabrication demandent des controles sur les matieres premieres (MP), les produits finis (PF) ainsi que des etudes de stabilite sans en preciser les modalites. Le dosage de la MCh, du BC et leurs impuretes de degradation, la betamethylcholine (βMC) et l’ammonium, etaient realisees par 5 methodes d’analyse differentes, dont 4 en chromatographie liquide haute performance avec des temps d’analyse et de conditionnement de colonnes et de detecteurs tres longs. Les structures de la MCh et du BC etant proches, l’objectif de ce travail etait de mettre au point une methode d’analyse commune pour ces deux composes et leurs substances apparentees afin d’optimiser les temps analytique et de gagner en productivite. Materiels & methode Les separations de la MCh, du BC, de la βMC et de l’ammonium ont ete realisees sur 2 colonnes echangeuses de cations IonPac ® CS14 et CS17 (150 × 4,0 mm, 8 et 7 μm respectivement) thermostatees a 30 °C avec differentes phases mobiles (PM) composees d’acide methanesulfonique (MSA) de 2,60 a 50 mM en isocratique ou en gradient, a un debit de 1 mL/min. Le volume d’injection etait de 20 μL pour les analyses (dosage et impuretes) concernant la MCh et de 25 μL pour celles du BC. La detection etait conductimetrique. Pour chacune des conditions testees, la specificite, la resolution, l’efficacite et le temps d’analyse ont ete etudies ainsi que la repetabilite et la linearite pour les plus satisfaisantes. Resultats & discussion Aucune PM utilisee sur la CS14 n’a permis d’obtenir une efficacite satisfaisante. Les methodes USP de dosage de la MCh et de ses substances apparentees (CS17, MSA 5,20 mM, 1 mL/min) ont donne les meilleurs resultats avec une bonne efficacite pour la MCh et le BC (3278 et 4882 plateaux theoriques), une bonne resolution (superieure a 1,5), un temps d’analyse inferieur a 20 minutes, ainsi qu’une bonne repetabilite : coefficients de variation des solutions standards du dosage MCh, de la βMC dans les impuretes MCh, du dosage BC et de la βMC dans les impuretes BC respectivement de 0,90 %, 6,59 %, 1,32 % et 0,22 % ( n  = 5), soit dans les limites definies par les monographies USP de la MCh et du BC. L’ammonium n’a pu etre separe des pics presents dans le chromatogramme du solvant de dilution. Le passage d’une gamme de 40 a 60 μg/mL de MCh a permis d’obtenir un coefficient de determination de 0,999. Un effet memoire a ete observe pouvant influencer l’essai de teneur limite en impuretes, et necessite donc l’injection de quelques blancs entre les echantillons a analyser. Il n’y a pas d’excipients dans les produits finis pouvant influencer la methode de dosage. La mise au point etant finalisee, la methode pourra etre validee par la suite. Conclusion Une seule methode analytique optimisee a ete developpee pour le controle de la MCh et du BC (MP et PF), excepte pour l’impurete ammonium. En utilisant une unique PM, ce qui reduira les durees de conditionnement de la colonne, elle permettra un gain de temps analytique et d’efficacite.