Efeitos de variações intrônicas em genes de enzimas esteroidogênicas sobre o processo de splicing

O estudo da relacao entre erros no processo de splicing e a ocorrencia de doencas se tornou uma questao importante no campo da pesquisa medica. As alteracoes que afetam o mecanismo de splicing podem ser a causa direta de doenca, podem tambem modificar a gravidade fenotipica, assim como podem estar ligadas a uma maior susceptibilidade de desenvolver doencas. As mutacoes de splicing, que em muitos casos originam transcritos nao funcionais, tem sido identificadas na grande maioria dos genes envolvidos nos disturbios da diferenciacao do sexo em humanos. A presenca de alteracoes ou mutacoes em alguns destes genes, pode comprometer a biossintese correta de proteinas essenciais para o desenvolvimento adequado das gonadas ou dos genitais externos. Atraves da tecnica de minigene, foram estudadas mutacoes presentes em regioes intronicas, em tres genes essenciais para a correta diferenciacao sexual humana: SRD5A2, HSD17B3 e CYP21A2 . O objetivo era verificar se alteravam o mecanismo de splicing normal ou criariam sitios alternativos de splicing. Para o gene SRD5A2, foram estudadas duas alteracoes: c.548-44T>G, proxima a regiao aceptora de splicing do intron 3; e, a alteracao c.278delG, dentro da regiao doadora de splicing do intron 1. Os minigenes mutante e controle produziram transcritos com splicing normal, splicing alternativo produzindo um transcrito com 112 nucleotideos deletados e um transcrito com o skipping do exon 4, porem em quantidades diferentes, o que sugere que esta alteracao pode causar um desbalanceamento entre os transcritos normalmente produzidos. A mutacao c.278delG, por sua vez, fez com que o spliceossomo reconhecesse um sitio 5? de splicing alternativo dentro do exon 1 do gene SRD5A2, produzindo um transcrito com a delecao de 38 nucleotideos. Este transcrito apresenta um codon de parada de sintese proteica prematuro na posicao 121. No gene HSD17B3 foi estudada a alteracao c.277+2T>G, que se localiza na regiao doadora de splicing no intron 3. Neste caso o unico transcrito observado como resultado do minigene mutante apresentava o skipping do exon 3 do gene HSD17B3. No gene CYP21A2 foram analisadas duas alteracoes: a primeira alteracao e a c.939+5G>A, localizada na regiao doadora de splicing do intron 7, e a segunda e a c.289+127T>G, no intron 2. De forma semelhante a observada para a alteracao c.548-44T>G do gene SRD5A2, tanto os minigenes controles quanto os mutantes produziram os mesmos transcritos, mas em proporcoes quantitativamente diferentes. Estes resultados indicam que o sistema de minigene foi adequado para o estudo, embora os resultados tenham sido mais conclusivos para as alteracoes localizadas nas sequencias consenso de splicing, isto e para as c.278delG no gene SRD5A2 e c.277+2T>G no gene HSD17B3. Os resultados das demais alteracoes sugerem que a transcricao dos genes em questao produzam normalmente diferentes transcritos, mas mediante as trocas nucleotidicas, as proporcoes entres eles se alteram, podendo assim, afetar a funcao genica correta em alguma fase crucial do desenvolvimento. Estes achados colaboraram para o esclarecimento e compreensao do fenotipo dos pacientes portadores das mutacoes aqui descritas, alem de propiciar um melhor entendimento dos efeitos biologicos na transcricao de genes quando na presenca das mutacoes intronicas. Portanto, o estudo de alteracoes em sitios de splicing atraves da analise de minigenes torna-se fundamental tanto para o esclarecimento do diagnostico clinico, como tambem para uma melhor comprenssao dos efeitos das mutacoes sobre os mecanismos moleculares de sp