New activity-based probes to detect matrix metalloproteases

Les Metallo Proteases Matricielles (MMP) en tant qu'endopeptidases a zinc ont une large gamme de fonctions biologiques allant du remodelage tissulaire a la modulation de la reponse cellulaire. Une modification de leur activite proteolytique est souvent associee a de nombreux desordres biologiques. In vivo, ces proteases sont soumises a de nombreuses modifications post-traductionnelles. Elles sont secretees sous formes latentes a l'exterieur des cellules pour etre ensuite transformees en forme fonctionnelles. Ces dernieres sont ensuite inhibees par des inhibiteurs endogenes. En raison de leur secretion dans l’espace extra cellulaire, les MMP sous formes actives ont longtemps ete considerees comme de simples ciseaux moleculaires capable de degrader uniquement la matrice extracellulaire. Cependant, le remodelage tissulaire ne constitue pas la fonction unique et encore moins la fonction principale de ces enzymes. Elles peuvent en effet cliver une grande variete de substrats non matriciels et a ce titre sont impliquees dans la progression tumorale, l'immunite et l'inflammation. Pour ajouter une complexite supplementaire a la biologie des MMP, il a ete recemment montre que certaines MMP ont une localisation intracellulaire associee a des fonctions non proteolytiques. Ces observations, mais aussi celles montrant que ces protease participent a la progression de la maladie alors que d'autres ont une fonction protectrice, soulignent la necessite de mieux documenter leur activation spatiale et temporelle dans divers contextes biologiques.Le profilage proteique base sur l'activite vise a analyser l'etat fonctionnel des proteines dans des echantillons biologiques complexes. A cette fin, des sondes basees sur l'activite (ABP), qui reagissent avec les enzymes en s’appuyant sur leur mecanisme catalytique, ont ete developpees pour la detection d’enzymes sous formes actives, notamment dans le cas des proteases a serine et a cysteine. Une sonde basee sur l’activite (ABP) est classiquement composee : i) d’un groupement reactif conduisant a la modification covalente de residus au sein du site actif de l’enzyme, ii) d’un motif de liaison imposant la selectivite au groupement reactif et iii) d’un groupement rapporteur permettant la detection des enzymes ciblees. Cette approche ne s’applique toutefois pas aux MMP, pour lesquelles il n’existe pas de residus nucleophiles conserves au sein du site actif. A cet egard, tous les ABP ciblant les MMP comportent un groupement photo activable qui, sous irradiation UV, favorise la formation du complexe covalent. De telles sondes photo sensibles ont permis de detecter les MMP sous leurs formes actives dans des tissus et des fluides, mais pas chez les animaux vivants au sein desquels l’etape de photo-activation ne peut etre realise.Dans ce contexte, en nous appuyant sur un contexte structural favorable et en exploitant la chimie de l'acyl imidazole (LDAI) dirigee par un ligand, nous avons identifie une nouvelle serie de sondes capables de modifier de maniere covalente les MMP sans recourir a la photo-activation. Nous avons ainsi valide la capacite de ces sondes a marquer de maniere selective et efficace la MMP12 humaine in vitro et dans des proteomes complexes. Dans ce dernier cas, jusqu’a 50ng de hMMP12 correspondant a 0,05% du proteome total peuvent etre detectes. Nous avons egalement determine l'identite de l’unique residu modifie de facon covalente au sein du site actif de la hMMP-12 et verifie que cette modification avait peu d'impact sur l’activite proteolytique de cette derniere. Nous avons demontre que cette approche permettait de detecter des MMP endogenes. Enfin, nous avons etendu cette strategie de marquage a un panel plus large de MMP.En developpant la premiere strategie de marquage des formes actives de MMP «sans photo-activation», il semble maintenant possible d’envisager la detection de ces enzymes a la fois dans les proteomes complexes et in vivo.