Analise comparativa da expressão de genes de Xylella fastidiosa associados a patogenicidade e formação de biofilme

O presente trabalho tem como objetivo detectar e estudar a expressao de genes possivelmente envolvidos com patogenicidade da estirpe 9a5c de X. fastidiosa. Para desenvolvimento do trabalho foram utilizadas bacterias imediatamente apos o isolamento da planta sintomatica, denominado aqui isolamento primario (IP) e bacterias apos 46 repicagens (SR) sucessivas em meio de cultura. Uma possivel perda de virulencia da X. fastidiosa submetida as condicoes de SR foi verificada inoculando-se plantas de laranja doce (Citrus sinensis) e vinca (Cataranthus roseus) com as bacterias obtidas nestas condicoes. Atraves do uso de PCR quantitativo em tempo real, foi verificado que a colonizacao das celulas originadas de SR foi menos eficiente em ambos hospedeiros. A tecnologia de DNA `microarray` foi utilizada para investigar as mudancas da expressao genica associadas com a condicao IP. Verificou-se que muitos dos genes diferencialmente expressos codificam para proteinas hipoteticas. Genes potencialmente envolvidos com patogenicidade, virulencia e adaptacao foram induzidos apenas na condicao IP. Tres destes genes (fimA, hsf e uspA1) foram associados com adesao na superficie do hospedeiro e quatro (msrA, acrA, cvaC e xpsE) com a capacidade de adaptacao do patogeno no ambiente do hospedeiro. A inducao destes genes na condicao IP foi confirmada por RT-PCR tanto na condicao in vitro quanto na condicao in planta 15 dias apos inoculacao, periodo este que corresponde ao inicio da colonizacao. Contudo, 90 dias apos inoculacao, periodo de colonizacao mais avancada com o surgimento dos primeiros sintomas, o nivel de expressao dos genes de adesao foi similar em ambas condicoes de crescimento. Entretanto, uma maior expressao foi observada na condicao IP para os genes envolvidos com adaptacao no ambiente do hospedeiro. Estes resultados sugerem que a adesao e importante para o inicio da formacao do biofilme. Por outro lado, os genes relacionados com adaptacao sao essenciais para manutencao do biofilme in planta. Tambem, a expressao destes genes durante a formacao de biofilme in vitro em X. fastidiosa foi avaliada por RT-PCR semi-quantitativo apos 3, 5, 10, 20 e 30 dias de crescimento em superficie de vidro na interface liquido-ar. A expressao dos genes na condicao in vitro foi similar a condicao in planta, onde os genes de adesao tiveram uma maior inducao nas etapas inicias de formacao de biofilme. Estes resultados indicam que estes genes podem estar envolvidos com a adesao em diferentes superficies. Entretanto, apenas alguns genes relacionados a adaptacao (xpsE, acrA) se comportaram de forma similar ao observado in planta, ou seja, com maior inducao na etapa de biofilme maduro. Isto pode ser resultado dos diferentes ambientes experimentais utilizados, uma vez que, a expressao destes genes pode ser regulada de acordo com o ambiente pela qual a bacteria e exposta. Analises de microscopia otica em diferentes fases do biofilme formado em lâminas de vidro revelaram que a formacao de biofilme em X. fastidiosa apresenta pelo menos cinco fases distintas, sendo aos 20 dias a fase de maior densidade celular. Varios sao os estudos que visam detectar os genes expressos em diferentes fases e ambientes da formacao de biofilme, principalmente em bacterias que causam doencas em humanos, uma vez que, a formacao do biofilme tem sido atribuida como a causa de serias doencas. Contudo, ha poucas informacoes em relacao a expressao de genes envolvidos na formacao de biofilme em patogenos de plantas. Por este motivo, e como a formacao de biofilme indica ser o mecanismo primario de patogenicidade de X. fastidiosa, foi utilizada a tecnologia do DNA ´microarray´ para avaliar os genes expressos na fase de biofilme maduro comparado ao crescimento planctonico. Um total de 202 genes (9,18%) foram significativamente induzidos, enquanto que 32 genes (1,45%) foram reprimidos na condicao de biofilme. A maioria dos genes diferencialmente expressos codifica para proteinas ainda hipoteticas. Na condicao de crescimento em biofilme foi verificado um aumento da expressao de genes ?housekeeping? que codificam funcoes metabolicas. Tambem foi detectado um grande numero de genes do mega plasmidio pXF51 sendo diferencialmente expresso, o que poderia provavelmente estar associado com transferencia horizontal de genes em X. fastidiosa em biofilme. Em relacao a categoria de patogenicidade, a maioria dos genes expressos na condicao de biofilme foram associados com producao e detoxificacao de toxinas e adaptacao para crescimento em condicoes atipicas. A expressao destes genes associados com adaptacao pode conferir caracteristicas competitivas a X. fastidiosa no habitat a ser colonizado, dando uma clara indicacao da importância destes fatores no estabelecimento do biofilme. Tais afirmacoes demonstram que a propriedade fisiologica do biofilme de X. fastidiosa e similar ao observado em bacterias patogenicas em humanos, indicando que a formacao de biofilme como mecanismo de patogenicidade de bacterias de diferentes hospedeiros apresentam caracteristicas comuns. Abstract