稳定表达 TIGAR 基因的BHK-21细胞系的构建及其对新城疫病毒增殖效果的评价

TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR）是p53下游的靶基因，具有调节糖酵解水平和抗细胞凋亡功能。由于新城疫病毒（NDV）引起细胞死亡是通过诱导凋亡产生，所以提高宿主细胞的抗凋亡水平，有助于延长细胞存活时间进而提高子代病毒的滴度。本研究根据GenBank中预测仓鼠TIGAR基因和鸡TIGAR基因设计引物，分别扩增仓鼠和鸡的TIGAR基因，并构建各自的慢病毒包装质粒，以适合NDV增殖的BHK-21细胞为基础构建稳定过表达TIGAR细胞系（BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR）。使用Western blot、DNA测序和qPCR对TIGAR基因表达水平进行鉴定，Western blot和流式仪检测细胞的自然凋亡率。选取新城疫病毒强中弱3种毒株分别感染构建的细胞系，测定病毒滴度。结果显示：重组细胞系BHK-21-chTIGAR细胞和BHK-21-hamTIGAR细胞经过Western blot和DNA测序等检测表明构建成功，TIGAR基因表达量高且无野生型BHK-21细胞污染。qPCR检测细胞系的稳定性结果显示，TIGAR基因在BHK-21细胞中经过30次传代均可稳定表达。Western blot和流式细胞检测结果显示：BHK-21-hamTIGAR细胞的凋亡率低于野生型BHK-21细胞和BHK-21-chTIGAR细胞；病毒生长曲线结果显示：强毒株ZJ1病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID50（5.67，72 h）高于BHK-21-chTIGAR细胞（5.53，72 h）和野生型BHK-21细胞（5.27，72 h）；中强毒株SH15病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID50（4.90，96 h）要高于BHK-21-chTIGAR细胞（4.57，96 h）和野生型BHK-21细胞（4.67，96 h）；弱毒株LaSota病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID50（4.07，96 h）要高于BHK-21-chTIGAR细胞（3.90，96 h）和野生型BHK-21细胞（3.77，96 h）。综上所述，所构建的BHK-21-hamTIGAR细胞系具有明显的抗凋亡功能，且有利于新城疫病毒的高水平复制，有望进一步开发完善成为新城疫病毒疫苗生产所用的细胞株。