Produção de uma linhagem celular de tumor de mama silenciada estavelmente para a integrina β3 e estudo de suas funções

INTRODUCAO: A metastase e a principal causa de morte de pacientes com câncer, estagio para o qual as opcoes terapeuticas para a doenca ainda sao limitadas. O microambiente tumoral, a matriz extracelular (MEC) e as integrinas sao componentes essenciais no desenvolvimento da metastase. Integrinas sao receptores de adesao que interagem com componentes da MEC promovendo a progressao tumoral. A integrina αvβ3 e altamente expressa em celulas tumorais, contribuindo para a invasao tumoral e formacao de metastase ossea, e sua inibicao e, portanto, uma ferramenta valiosa para a elucidacao dos mecanismos moleculares envolvidos na disseminacao tumoral. OBJETIVO: O objetivo deste projeto foi produzir a linhagem celular de tumor de mama triplo negativa MDA-MB-231 silenciada para a integrina β3, bem como estudar os efeitos desse silenciamento na funcionalidade da celula. METODOLOGIA: Celulas 293FT foram transfectadas com o mix contendo lipofectamina e os plasmideos de envelope (pMD2.G), empacotamento (psPAX2), e o de transfeccao com o shRNA β3 para a producao de lentivirus. Em seguida, as celulas foram cultivadas em DMEM high glucose (10% de soro fetal bovino (SFB), sem antibioticos) por 48h para a producao de particulas virais. O meio de cultivo das celulas 293 FT contendo o lentivirus foi coletado, adicionado de polibrene (8 µg/mL) e utilizado para transducao da celula alvo MDA-MB-231 durante 24h. Apos este tempo, o meio de cultura foi substituido por meio DMEM high glucose com 10% SFB. A selecao das celulas infectadas foi feita por meio de adicao do antibiotico puromicina (4 µg/mL). A verificacao do silenciamento da subunidade β3 foi realizada por Western Blotting (WB). RESULTADOS: Experimentos de WB confirmaram a ausencia da subunidade β3 nas linhagens silenciadas. Diante disso, foi possivel verificar diferencas no comportamento das linhagens parental e silenciada com relacao a morfologia e adesao das celulas tumorais de mama. CONCLUSAO: A linhagem tumoral KD-β3-MDA-MB-231 foi produzida estavelmente, apresentando algumas caracteristicas fenotipicas e funcionais diferentes de sua linhagem parental. Esta linhagem sera empregada em estrategias experimentais buscando o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na metastase, dos quais a integrina avb3 possui participacao ativa. Com isto, esperamos buscar respostas que expliquem a ineficiencia de inibidores de integrinas atualmente propostos como farmacos anticâncer. Financiamento: CAPES, CNPq, FAPESP [2013/00798-2]