Development of devices and techniques for electroporation and electrical impedance spectroscopy analysis of adherent cells

The present PhD dissertation is focused on the design and implementation of a microelectrode system capable of performing electroporation and electrical impedance measurements to adherent cell monolayers cultured in standard multiwell plates. Along the document, the ability of the proposed device to provoke cell electropermeabilization is first demonstrated. Subsequently, the system is applied in monitoring of the electroporation process by means of fast electrical impedance spectroscopy measurements. The original concept of the proposed system resides on the momentary placement of the microelectrodes above the cell monolayer avoiding physical contact with the cells by means of microseparators. A modification of the standard printed circuit board (PCB) fabrication technology that helps to improve the current density distribution is developed to manufacture the final microelectrode prototypes.This technology allows producing disposable devices at very low cost. The performance of the device is tested with different cell lines and using different molecules such as DNA and siRNA. The results confirm its usefulness but show considerable differences between permeabilization and transfection results. Subsequently, the specific characteristics of the device to perform electrical impedance measurements with a four-electrode method during the electroporation treatment are fully exploited. In this thesis a multisine-based measuring system capable of acquiring impedance spectra continuously with a time resolution of 1 spectrum/ms is used. In contrast to previous studies, the speed of the measuring system allows to perform full impedance spectroscopy measurements in the time gap between consecutive electroporation pulses and not only before and after the complete electric field application. The impedance results at low frequency show the ability of the system to detect the fast cell membrane resealing dynamics immediately after each pulse. These fast dynamics are related to the so called short-lived pores and follow a double exponential behavior. Also, an accumulated slow impedance decrease along the complete process is observed related to the long-lived pores. Complementary, the high frequency impedance response shows how the effect of the conductivity variation caused by the diffusion of ions between the intracellular and extracelluar media has also an impact on the impedance measurements. Different approaches are proposed in the analysis of the measurements of four different cell lines: the direct observation of impedance magnitude and phase, the study of Cole model parameters and the use of an equivalent electrical circuit. The comparative analysis suggest that for the detection of fast cell membrane dynamics, phase of impedance is preferable to its magnitude because it is less disturbed by the collateral conductivity variations. After deep analysis of Cole parameters, an equivalent time constant combining the information of the Cole parameters tau and alpha is proposed as a general analysis parameter for the fast membrane changes. Lastly, the equivalent circuit is useful in order to give or to confirm a physical interpretation to the observed results. Finally, regarding the slow impedance decrease, it shows a non linear permeabilization rate with pulse number for high electric field intensities, suggesting the existence of a limit for new pore creation with increasing pulse number. It is also demonstrated how the total impedance variation at the end of the treatment can be used as a reliable marker of the success of cell eletropermeabilization with some advantages with respect to traditional chemical methods. The results shown in this thesis demonstrate how fast electrical impedance spectroscopy measurements during an electroporation procedure represent a reliable and alternative method for online monitoring the fast changes produced in the membranes of the sample under treatment. La presente tesis doctoral se centra en el diseno y la implementacion de un sistema de microelectrodos especificamente concebidos para su aplicacion en electroporacion y medidas de espectroscopia de impedancia electrica (EIS) de celulas adherentes creciendo en placas multipocillo estandar. En primer lugar se demuestra la habilidad de sistema propuesto para provocar la electropermeabilizacion celular. A continuacion, el sistema se aplica en la monitorizacion del proceso de electroporacion mediante medidas rapidas de EIS. La novedad en el concepto del sistema propuesto reside en el posicionamiento momentaneo del sistema de microelectrodos sobre la monocapa celular evitando el contacto fisico por medio de microseparadores. Para la fabricacion del prototipo final se desarrollo una modificacion en la tecnologia de fabricacion de circuito impreso estandar que ayuda a mejorar la distribucion de la densidad de corriente. Esta tecnologia permite la produccion de dispositivos desechables a precio bajo. El funcionamiento del sistema se testa con diferentes lineas celulares y diferentes moleculas como ADN y siARN. Los resultados confirman su utilidad, pero muestran diferencias considerables entre las tasas de permeabilizacion y de transfeccion obtenidas. Posteriormente, se explotan completamente las caracteristicas especificas del dispositivo para la obtencion de medidas de impedancia electrica durante la electroporacion utilizando una estrategia a 4 hilos. En esta tesis se utiliza un sistema de medida basado en multisenos capaz de adquirir espectros de impedancia con una resolucion temporal de 1 espectro/ms. En contraposicion a estudios previos, la velocidad del sistema de medida permite realizar multiples medidas completas de espectroscopia en el tiempo entre pulsos de electroporacion consecutivos y no solo antes y despues del tratamiento. Los resultados a baja frecuencia muestran la habilidad del sistema para detectar la dinamica rapida de recuperacion de la membrana despues de cada pulso. Esta dinamica es debida a los conocidos como poros de vida corta y sigue un comportamiento exponencial doble. Ademas, se observa un descenso lento y acumulado a lo largo del proceso completo debido a los poros de vida larga. Por otro lado, la respuesta de impedancia a alta frecuencia muestra como el efecto de la variacion de conductividad causada por la difusion de iones entre los medios intra y extracelular tiene impacto en las medidas de impedancia. Se proponen varias aproximaciones para el analisis de las medidas realizadas en cuatro lineas celulares diferentes: la observacion directa de la magnitud y fase de la impedancia, el estudio de los parametros del modelo de Cole y el uso de un circuito electrico equivalente. El analisis comparativo sugiere que para la deteccion de los cambios rapidos en la membrana, la fase de la impedancia es preferible a su magnitud debido a que el cambio colateral de conductividad afecta menos a la fase. Tras el analisis profundo de los parametros de Cole, se propone la utilizacion de una constante de tiempo equivalente combinando la informacion de tau y alfa del modelo de Cole como un parametro de analisis general. Finalmente, el circuito equivalente es util para confirmar y ayudar a dar una interpretacion fisica de los resultados observados. En cuanto al descenso lento de impedancia, se observa una tasa de permeabilizacion no lineal para las intensidades de campo electrico mas altas, sugiriendo la existencia de un limite para la creacion de nuevos poros con el numero de pulso. Tambien se demuestra como la variacion total de impedancia al final del tratamiento puede ser utilizada como un marcador del exito de la permeabilizacion celular con ventajas respecto de los metodos quimicos tradicionales. Los resultados presentados en esta tesis muestran como las medidas rapidas de EIS durante un procedimiento de electroporacion son un metodo alterativo fiable para la monitorizacion en tiempo real de los cambios producidos.