구연 : 제한효소분절질량다형성(RFMP)을 이용한 라미부딘 내성 B형 간염바이러스의 검출

배경/목적: 만성B형간염의 치료에 사용되는 뉴클레오사이드 유도체인 라미부딘은 지속 사용시 B형간염바이러스(HBV)의 중합효소인 P 유전자에 돌연변이를 유발하게 되는데, 중합효소의 활성 부위인 tyrosine, methionine, aspartate, aspartate (YMDD) motif의 M552I (YIDD)와 M552V (YVDD)가 내성을 유발하는 주요 돌연변이로 보고되고 있다. 현재 제한효소분절길이다형성(RFLP), 염기서열분석 및 hybridization (LiPA) 방법이 내성 바이러스의 분석에 활용되고 있으나, 1) 야생형과 변이형 혼합감염의 진단이 어려운 점 (RFLP, 염기서열분석, LiPA), 2) 임상적 응용 범위가 협소한 점(RFLP), 3) 분석 기술의 사용이 불편한 점 (RFLP, 염기서열분석), 4) 새로운 변이의 동정이 어려운 점(RFLP, LiPA), 5) 고비용(염기서열분석, LiPA)의 문제점으로 인해 임상적 사용이 크게 제한을 받고 있는 실정이다. 본 연구는 자동화 말디토프 (MALDI-T) 질량 분석 기술을 응용한 제한효소분절질량다형성(Restriction Fragment Mass Polymorphism, RFMP) 방법을 이용하여 내성 바이러스의 검출과 새로운 변이형의 동정을 대용량으로 정확하게 수행할 수 있는 지의 여부를 알아보고자 하였다. 대상과 방법: Type IIS 제한효소의 인지 부위를 포함하며 HBV P 유전자의 YMDD motif의 upstream에 결합하도록 제작된 특수 시발체(primer)를 이용하여 중합연쇄반응(PCR) 반응을 하고, 해당 제한효소로 절단하게 되면, YMDD motif를 포함하는 7mer와 13mer의 올리고머가 형성된다. 이 두 가지의 올리고머 (allele-diagnostic fragments)는 YMDD motif에 출현하는 돌연변이의 종류에 따라 특정 질량을 가지게 되는데, 이 두 분자의 질량을 말디토프 질량분석기에서 측정함으로써 바이러스의 변이를 파악하게 된다. 결과: RFMP 방법의 검출한계와 야생형과 변이형 바이러스가 공존할 때의 식별능력을 분석하였을 때, 야생형 중에 변이형의 비율이 0.1% 미만일 때, 그리고 혈청 1mL 당 HBV 게놈이 100 copies까지도 유의하게 변이 바이러스를 검출하였다. 기존 방법인 RFLP와 sequencing으로 HBV 변이형이 동정되었던 환자 20명의 혈청을 RFMP 방법으로 분석한 결과, 정확성 외에도 바이러스 breakthrough 6개월 전에 변이 바이러스의 출현을 조기 검출할 수 있었다. 또한 RFLP 방법에 의해 검출하지 못한 새로운 바이러스 변이들을 검출하였고 중복 감염시 혼합 바이러스 간의 상대적 양을 파악할 수 있었다. 결론: RFMP 방법은 높은 정확도, 민감도, 변이 바이러스 특이도 및 중복 감염 바이러스의 상대량 분석능력을 갖는 새로운 내성바이러스 검출 방법으로 대량의 임상 샘플을 신속한 처리가 가능하므로 라미부딘 및 항바이러스제 치료 예후 및 질환 경과의 임상적 이해에 활용되길 기대한다.