Ingénierie de lectines de valence, topologie et spécificité contrôlées pour la biologie cellulaire et la biotechnologie

La capacite des lectines a reconnaitre specifiquement des glycoconjugues a la surface de cellules en font des outils de diagnostic biomedical pour les pathologies associees a des changements de glycosylation (inflammation, du cancer ...). De par leur interaction avec les glycosphingolipides, ces proteines peuvent aussi etre utilisees pour etudier le trafic membranaire. Toutefois, un nombre reduit de lectines sont actuellement disponibles, limitant leur utilisation dans les biotechnologies et la recherche. Le but de ma these est d'une part de concevoir des neo-lectines de valence et topologie controlees pour comprendre l'effet de la multivalence sur le mecanisme d'endocytose, et d'autre part de concevoir des lectines de specificite modulable afin de les utiliser dans la reconnaissance specifique des cellules tumorales.RSL est une lectine a fucose de la bacterie Ralstonia solanacearum qui a une structure en β-propeller formee par l'association de trois monomeres presentant deux sites de liaison tres similaires. Cette proteine trimerique et hexavalente a ete choisie comme structure de base pour la conception de neolectines. Des RSLs trivalentes ont ete produites par mutation d'un acide amine essentiel pour la stabilisation du fucose. Leur caracterisation a demontre qu'ils avaient perdu la capacite d'invaginer la membrane plasmique. Une proteine de meme structure que RSL mais monomerique a ete ingenieree, puis une librairie de plus de 13 mutants de valence presentant differentes topologies a ete creee. L'analyse de tous les mutants a permis de demontrer que la formation de tubules dans les membranes depend plus de la distance entre les sites que du nombre de sites.Nous avons ensuite mis au point un protocole de bio-informatique afin de predire l'orientation et la conformation d'oligosaccharides fucosyles dans les sites de fixation de plusieurs lectines a fucose. Les affinites relatives ont pu etre calculees avec une bonne correlation avec les valeurs experimentales. La modelisation et la structure cristallographique des complexes entre RSL et les oligosaccharides Lewis X et Sialyl Lewis X indiquent un changement conformationnel du glycanne tres inhabituel lors de l'interaction, donnant ainsi des pistes pour la conception de mutants de plus haute specificite.