逆转录环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测草鱼( Ctenopharyngodon idellus )呼肠孤病毒(GCRV)的研究

草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）是一种双链分节段RNA病毒，是引起草鱼出血病的（hemorrhage of grass carp）的病原，目前临床上较为流行的为基因Ⅰ型和Ⅱ型GCRV。本研究利用逆转录环介导等温扩增技术（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）进行核酸扩增，通过横向流动试纸条方法（lateral flow dipstick，LFD）进行可视化检测，分别建立了可应用于基因Ⅰ型和Ⅱ型GCRV快速检测的RT-LAMP-LFD技术。该技术以基因Ⅰ型和Ⅱ型GCRV第六基因为检测靶标，分别设计了2对特异性引物（其中，上游内引物由生物素biotin标记）和1条异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的探针。结果表明，RT-LAMP最适反应温度为63℃，扩增时间为40min，从核酸扩增到LFD结果判读仅需50min。利用RT-LAMP-LFD可特异性检出基因Ⅰ型和Ⅱ型GCRV，而对鲤疱疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）、鲤春病毒血症病毒（SVCV）、嗜水气单胞菌等鱼类常见病原的核酸检测结果为阴性，而且两种基因型RT-LAMP-LFD方法只能检测本基因型GCRV，特异性良好。该方法最低可检测到1.19pg的基因Ⅰ型GCRV的RNA，1.88pg基因Ⅱ型GCRV的RNA，其灵敏度分别比相应的RT-PCR方法高2个数量级和1个数量级。对实际样品的检测结果表明，两种基因型RT-LAMP-LFD方法检测GCRV与普通RT-PCR扩增并测序的结果一致。因此，该方法可快速、特异地检测出GCRV，而且操作简单，费用低且耗时短，不需特殊仪器设备，有望成为GCRV现场检测的常规技术手段。