Expressão, caracterização e purificação de adesinas envolvidas na formação do biofilme de Xylella fastidiosa

E inquestionavel a importância da participacao da citricultura na economia brasileira. O Brasil e o maior exportador de suco concentrado do mundo. Em 2007 as exportacoes brasileiras quase alcancaram 400 milhoes de caixas de laranja, retrato de uma cultura que gera uma diversidade enorme de empregos diretos e indiretos, movimentando tambem a industria de insumos. O estado de Sao Paulo tem maior destaque nessa producao e no final dos anos 80 foi severamente prejudicado pela Clorose Variegada dos Citros (CVC), uma doenca que acarreta danos da ordem de milhoes de dolares por diminuir o tamanho dos frutos e, por consequencia, a quantidade de suco produzido. Foi comprovado que a bacteria causadora da CVC e a Xylella fastidiosa, um fitopatogeno de crescimento limitado ao xilema. Devido a importância da citricultura para o estado de Sao Paulo, a X. fastidiosa teve seu genoma completo sequenciado e foram encontrados diversos genes relacionados a adesao, muitos deles similares a patogenos de humanos e animais. Isso sugeriu que a adesao e a formacao do biofilme fossem fatores essenciais para a sobrevivencia da bacteria na planta. Essa hipotese e reforcada pelo fato de plantas sintomaticas apresentarem colonias de bacterias aderidas nas paredes dos vasos do xilema. Trabalhos posteriores comprovaram que sua colonizacao se da pela formacao de um biofilme que ocasiona o bloqueio dos vasos, dificultando a eficiencia do transporte de agua e seiva pela planta. Nesse contexto, o estudo da participacao de proteinas de adesao, sejam elas fimbriais ou afimbriais, e fundamental para o entendimento da formacao e estrutura do biofilme. Por apresentarem funcoes distintas, adesinas fimbriais e afimbriais sao expressas em momentos diferentes durante a formacao do biofilme. Diante do exposto acima, o objetivo desse trabalho foi monitorar a expressao de duas adesinas fimbriais e duas adesinas afimbriais de X. fastidiosa envolvidas com a formacao do biofilme in vitro. Para tal, foram realizados Western blot e microscopia de fluorescencia utilizando anticorpos desenvolvidos contra as proteinas alvo. Os resultados revelaram que adesinas fimbriais se expressam preferencialmente nas fases iniciais do bioflme, enquanto que adesinas afimbriais estao expressas nas fases mais tardias, quando o biofilme ja apresenta tracos de agregacao celular. Esse padrao de expressao sugere que a adesao inicial da bacteria ao substrato seja mediada por proteinas fimbriais e a adesao celula a celula seja funcao de proteinas afimbriais. Alem disso, uma maior ou menor quantidade de cada proteina se encontra expressa em todas as fases o biofilme, sugerindo haver uma regulacao de expressao que resulta em interacao biologica entre elas, a fim de manter a estabilidade e estruturacao do biofilme. Com o objetivo de monitorar a expressao dessas adesinas in vivo, foram analisadas tambem seccoes ultrafinas de peciolos de vinca, hibisco e citros infectados e apresentando sintomas da doenca. Em todas as analises foi possivel detectar a presenca das proteinas alvo, comprovando que elas sao necessarias para o processo de infeccao da planta pela bacteria. Os resultados aqui apresentados demonstram que proteinas fimbriais e afimbriais, assim como em patogenos de humanos, sao necessarias para a formacao do biofilme de X. fastidiosa. Este e o unico fitopatogeno cujo mecanismo de patogenicidade e a formacao de um biofilme. Neste sentido, os resultados aqui apresentados sao importantes no auxilio de possiveis controles de doencas formadas por biofilmes, uma vez que o tempo de expressao de cada adesina foi determinado, elas poderiam ser neutralizadas antes de desempenharem suas funcoes, quebrando a estabilidade do biofilme atraves da interrupcao da interacao entre as proteinas Abstract