Caracterización molecular y fenotípica de nuevos genes causales del síndrome cornelia de lange

El Sindrome de Cornelia de Lange (SCdL) es una patologia del desarrollo de origen genetico que se caracteriza por unos rasgos faciales distintivos, retraso pondoestatural y psicomotor, discapacidad intelectual, malformaciones de las extremidades, hirsutismo y afectacion variable de otros sistemas. La prevalencia del sindrome se estima entre 1/45.000 ? 1/62.000 recien nacidos vivos. Tiene una herencia autosomica dominante (NIPBL, SMC3, RAD21) o ligada al X (SMC1A, HDAC8), siendo la mayoria de los casos esporadicos, aunque tambien existen casos familiares. Los cinco genes causales tienen en comun codificar componentes estructurales o reguladores del complejo cohesina, y en conjunto las mutaciones de estos genes afectan al 80% de los individuos con SCdL. El complejo cohesina es esencial en el funcionamiento de muchos procesos biologicos, entre los que destacan la segregacion cromosomica, la reparacion del DNA, la regulacion de la expresion genica y la remodelacion de la cromatina. El complejo tiene forma de anillo que rodea la cromatina y esta formado por diferentes componentes estructurales primarios (SMC1A, SMC3, RAD21/REC8 y STAG-1+2+3) y componentes secundarios asociados (ESCO2, HDAC8, PDS5A/B, WAPL, MAU2 y NIPBL). Estos dos ultimos, NIPBL y MAU2, conforman a su vez un heterodimero denominado ?Adherina? o mas recientemente ?kollerina?, que facilita la carga del anillo de cohesina a la cromatina. En esta tesis doctoral se han perseguido varios objetivos, comenzando en un primer lugar por la identificacion de nuevos genes causales del SCdL en pacientes con fenotipo compatible. Ademas, una vez que los pacientes disponian de diagnostico molecular, se ha profundizado en la caracterizacion de sus fenotipos asociados, e incluso en el estudio de casos de coexistencia de mas de un sindrome. Por ultimo, con el objeto de ahondar en los mecanismos fisiopatologicos subyacentes, se ha llevado a cabo la caracterizacion de la interaccion de NIPBL con otras proteinas del complejo cohesina. Los dos primeros trabajos, son fruto de una revision detallada de los antecedentes y estado actual del SCdL al principio de esta tesis doctoral. El primer trabajo de caracter cientifico-educativo, esta dirigido a estudiantes y profesionales de la medicina. El segundo trabajo esta disenado como una herramienta de ayuda al diagnostico para el profesional sanitario. En el tercer trabajo, se participo en el descubrimiento del tercer gen causal, SMC3, con la identificacion de una delecion in-frame en un unico paciente. Ademas se hallaron 8 mutaciones diferentes en SMC1A, que mantenian el marco de lectura. En estos casos, el mecanismo patogenico se asociaba al efecto negativo dominante de la proteina mutada, y aunque pudieran formarse complejos de cohesina activos, la dinamica de union a los cromosomas podia verse alterada. El fenotipo asociado fue similar en ambos sexos, con unos rasgos clinicos mas discretos que el SCdL clasico, menor retraso pondoestatural, ausencia de grandes anomalias estructurales y discapacidad intelectual variable. En el cuarto trabajo, se llevo a cabo el primer estudio molecular de los genes: NIPBL, SMC1A y SMC3, en poblacion espanola, permitiendo identificar 11 mutaciones en el gen NIPBL, y 3 en el SMC1A. En cambio en el gen SMC3, tan solo se encontraron 29 polimorfismos. Las correlaciones genotipo-fenotipo mostraron un cuadro clinico mas grave en los pacientes NIPBL-positivos que en los SMC1A-positivo o sin diagnostico genetico. Los pacientes con mutaciones en el gen SMC1A destacaron por tener la incidencia mas alta de alteraciones en el paladar y uno de ellos padecio un complejo Sandifer. En el quinto trabajo, se participo en el descubrimiento del cuarto gen causal, RAD21, identificandose seis pacientes que portaban 4 deleciones intragenicas y 2 mutaciones missense. Sus rasgos faciales se solapaban con los caracteristicos del SCdL pero eran mas discretos. Ademas, presentaban en menor grado discapacidad intelectual, retraso en el crecimiento y anomalias musculoesqueleticas. Las mutaciones identificadas en RAD21 alteraban su interaccion con los componentes de las cohesinas SMC1A y STAG1+2, y tres funciones basicas del complejo: la cohesion de las cromatides hermanas, la respuesta al dano celular y la regulacion de la expresion genica. Ademas, los resultados mostraban que la mutacion missense que presentaba una actividad adicional, generaba mayores defectos funcionales y causaba unos rasgos clinicos estructurales y cognitivos mas graves, que la otra mutacion missense asociada a una perdida de funcion. En el sexto trabajo, se reporto el hallazgo de 21 mutaciones en el gen HDAC8 y se describieron las caracteristicas clinicas presentes en los 38 individuos identificados hasta ese momento. El patron de herencia estaba ligado al X, por lo que los varones presentaban un fenotipo con mayor grado de afectacion sistemica, mientras que las mujeres tenian mas variabilidad clinica. Ademas, la heterogeneidad del sexo femenino parecia relacionada con el grado de inactivacion del cromosoma X. Los pacientes con mutaciones en HDAC8 presentaban una facies y afectacion organica similar al SCdL clasico, aunque tambien mostraban rasgos clinicos distintivos como cierre de la fontanela anterior tardio, hipertelorismo ocular, parpados redundantes, punta nasal ancha o bulbosa y diastema dentario en los incisivos superiores. Tambien se valoro el efecto funcional de las mutaciones mediante su localizacion en la estructura cristalina previamente descrita, y la medicion de su actividad enzimatica, demostrandose la perdida de funcion como mecanismo patologico. En el septimo trabajo, se confirma que el gen SMC3 puede producir el sindrome, gracias al hallazgo de 15 pacientes SMC3-positivos, despues de ocho anos de la descripcion del primer paciente. Ademas, se caracteriza el fenotipo asociado a este gen, similar al de los pacientes SMC1A, pero que difiere del clasico de los NIPBL-positivos. Los pacientes muestran una microcefalia postnatal con un fenotipo facial distintivo alrededor de la region periorbital y nasal, leve retraso en el crecimiento prenatal que empeora durante la infancia, defectos cardiacos congenitos, ausencia de reduccion de las extremidades y discapacidad intelectual aunque sin graves problemas de comportamiento. El analisis de las mutaciones sugiere que aquellas que no alteran el marco de lectura actuan mediante un efecto dominante negativo, sin embargo, la identificacion de la primera mutacion nonsense apoya la haploinsuficiencia o la perdida de funcion como mecanismo concurrente. En el octavo trabajo, se describe el caso clinico de una paciente que presentaba simultaneamente SCdL debido a una mutacion en el gen NIPBL, y Sindrome de Turner con cariotipo mosaico 45,X/46,XX. Esta coincidencia de dos entidades nosologicas y la observacion de que ontogeneticamente la mutacion del gen NIPBL apareceria antes que la aneuploidia del cromosoma X, apoyaba la hipotesis de que las mutaciones del complejo de cohesinas podian relacionarse con alteraciones en la segregacion de los cromosomas. En el ultimo trabajo, se caracterizo la interaccion de las proteinas NIPBL y MAU2, y se evaluo la importancia de esta interaccion en el fenotipo del sindrome. Se refinaron los limites de los dominios de interaccion, confinandolos a los primeros 38 residuos de NIPBL y a los aminoacidos Phe32-Leu71 de MAU2. Posteriormente, la valoracion del efecto de las mutaciones demostro que tan solo dos de las ocho, que estaban en estos dominios, reducian la capacidad de union de NIPBL con MAU2. Sin embargo, no se apreciaron diferencias significativas entre el fenotipo de los pacientes con estas mutaciones, y el grupo control u otros pacientes con mutaciones missense en NIPBL, sugiriendose que otros factores adicionales a MAU2 podrian determinar las caracteristicas clinicas y la gravedad del sindrome.