Développement de capteurs d'interaction protéique pour la modélisation de lacroissance du muscle.

CONTEXTE et ENJEUX : Ce projet a pour but l’elaboration et la validation d’un systeme de mesure en temps reel de l'etat metabolique (physiologique et pathologique) des cellules musculaires, le but ultime etant de le transferer in vivo au muscle squelettique murin. Notre strategie est d’analyser l’etat d’activation des voies signaletiques clefs pour la survie et la destinee des cellules musculaires en etudiant l'interaction de certains de leurs composants moleculaires par le developpement de capteurs BRET (Bioluminescence Resonnance Energy Transfert). Une fois valides ces capteurs permettront de determiner in cellulo l'influence de stress environnementaux et de differents genotypes sur l'etat metabolique du muscle en developpement. Deux modeles de capteurs « predictifs » du muscle squelettique ont ete developpes; 1) le capteur 4EBP1/EIF4E qui mesure l’activation de la voie IGF-1/AKT/mTOR : Cette voie constitue la voie majeure de regulation de la croissance et de la survie du muscle squelettique. La determination de son etat d'activation repose sur l’analyse de l’interaction/dissociation entre les proteines 4EBP1/EIF4E, verrou ultime de l’initiation de la traduction des mARNs (et donc de la synthese proteique). 2) Le capteur mitofusines pour evaluer l'integrite des mitochondries musculaires : La biogenese et le metabolisme mitochondrial reposent sur un equilibre entre fusion et fission de ces organites qui conditionne in fine la survie cellulaire. L'heterodimerisation des proteines mitofusines Mfn1 et Mfn2 localisees a la surface externe des mitochondries controle ce cycle de fusion/fission. RESULTATS 1) Les differents plasmides necessaires au projet ont ete construits et les experiences de BRET ont demontre la faisabilite de l’approche pour detecter l’interaction en temps reel dans des cellules vivantes d’une part entre les Mitofusines d’autre part entre 4EBP1 et EIF4E. 2) La fonctionnalite du complexe 4EBP1/EIF4E a ete verifiee in vitro en demontrant l’interaction des proteines exogenes avec la coiffe 5’ des mRNAs (par immunoprecipitation sur billes de methyl- 7GTP-Sepharose). 3) Comme attendu nous avons observe par une approche biochimique que l’interaction entre 4EBP1 et EIF4E mesuree par BRET depend du niveau de phosphorylation de 4EBP1 (et donc de l’activation de la voie mTORC1). En effet l’introduction de mutations mimant les formes phosphorylees de 4EBP1 entraine une diminution de l’affinite entre 4EBP1 et EIF4E. Reciproquement, des mutants de 4EBP1 resistants a la phosphorylation par TORC1 ont une affinite accrue pour la proteine EIF4E. 4) La surexpression d’un inhibiteur de la voie mTORC1 (Redd1) augmente l’affinite entre 4EBP1 et EIF4E suggerant que le capteur 4EBP1/EIF4E est bien sensible a l’etat d’activation de la voie mTORC1. 5) En collaboration avec Julie Perroy (IGF CNRS Montpellier) nous avons determine par imagerie la localisation in cellulo du BRET mesure et nous observons qu’une part de l’interaction entre les mitofusines est bien localisee au niveau de la surface mitochondriale et d’autre part que celle du complexe 4EBP1/EIF4E s’effectue principalement au niveau du compartiment nucleaire.