Caracterización subcelular y por tejidos de la isoenzima HMG-COA Liasa Like 1

La proteina HMG-CoA Liasa humana (HL) es una enzima codificada por el gen HMGCL cuyo deficit provoca la aciduria 3-hidroxi-3-metilglutarica (OMIM 246450), enfermedad genetica poco frecuente, de caracter autosomico recesivo, que afecta a la ruta de sintesis de cuerpos cetonicos. En el ano 2004 se localizo en la base de datos `NIH The Mammalian Gene Collection? (MGC) un nuevo gen, el HMGCLL1, que tenia una gran homologia con el gen HMGCL. Los primeros resultados mostraron diferencias, pero tambien similitudes, entre ambos genes y proteinas. Sin embargo, quedaron sin responder aspectos importantes a los que se intento dar respuesta en este trabajo. Para ello se plantearon los siguientes objetivos: 1.Confirmar y definir el modelo estructural de la HL-Like1 mediante el intercambio de mutaciones homologas entre los genes HMGCL y HMGCLL1. 2.Identificar y caracterizar las posibles variantes fisiologicas de splicing del gen HMGCLL1. 3.Localizar a nivel subcelular la enzima HL-Like1 y estudiar la interaccion de la nueva enzima con la membrana del reticulo endoplasmico. 4.Caracterizar las constantes cineticas de la nueva isoenzima y su actividad por tejidos. 5.Caracterizar el nivel de proteinas HL y HL-Like1 en tejidos adultos y fetales desarrollando un anticuerpo especifico para la nueva enzima. 6.Estudiar la interaccion de la HL-Like1 con la tubulina. Para la realizacion del primer objetivo se reprodujeron mutaciones que provocaban la perdida de actividad de la enzima HL en los aminoacidos homologos de la HL-Like1 por medio de mutagenesis dirigida. Los resultados obtenidos mostraron la total falta de actividad de las proteinas HL-Like1 mutadas, lo que confirmaba de manera experimental la gran homologia existente entre ambas isoenzimas y la validez del modelo tridimensional propuesto. Para la caracterizacion e identificacion de posibles variantes de splicing se emplearon dos estrategias, una basada en la busqueda en bases de datos y otra experimental de amplificacion por fragmentos solapantes. Los resultados mostraron a la ?variante b? como la principal del gen HMGCLL1, ademas de un gran numero de transcritos alternativos. Estos se podian clasificar en variantes con insercion de exones (?variante a? y ?variante c?), y con delecion de exones. Las variantes de insercion parecian tener poca importancia al ser muy minoritarias y las de delecion no traducian proteinas activas. Las formas delecionadas eran sobre todo abundantes en tejidos adultos. El siguiente paso fue conocer la localizacion subcelular de nuestra proteina. Para ello se realizo un clonaje empleando proteinas fluorescentes, cuyo resultado fue que la HL-Like1 se localizaba en el reticulo endoplasmico de las celulas. Para completar este estudio, se hicieron experimentos de asociacion y disociacion de la proteina a las membranas del reticulo, estos mostraron que la HL-Like1 endogena se localizaba en las membranas del reticulo endoplasmico y que ademas tenia la capacidad para disociarse de las mismas, comportandose como una proteina periferica. Ademas su interaccion con la tubulina sugeria que estaba orientada hacia el citosol celular. La caracterizacion de las constantes cineticas de ambas proteinas mostro tambien diferencias en cuanto al nivel de actividad y a la afinidad por el sustrato. La HL-Like1 alcanzaba una velocidad maxima menor que la HL sin embargo, su afinidad por el sustrato era mayor. Estos datos confirmaban que nos encontrabamos ante enzimas de igual actividad pero con parametros cineticos diferentes. Otro objetivo de este trabajo fue conocer si existian diferencias en cuanto al nivel de actividad y de expresion por tejidos entre la HL-Like1 y la HL. Los experimentos de western-blot en tejidos fetales mostraron que la HL-Like1 solo se expresaba en cerebro fetal. Sin embargo, su presencia en tejidos adultos era mas variada, siendo elevada en pulmon, rinon y cerebro. Los ensayos enzimaticos arrojaron resultados similares y destacaron la elevada actividad de pulmon y cerebro. Estos tejidos coinciden en utilizar los cuerpos cetonicos como sustratos en la sintesis de lipidos complejos y sugieren que las funciones de la HL estarian mas orientadas al metabolismo energetico, mientras que las de la HL-Like1 podrian estarlo mas hacia el metabolismo plastico. Finalmente, se estudio la influencia de la tubulina acetilada sobre la HL-Like1. Los experimentos de co-inmunoprecipitacion y de actividad demostraron la interaccion entre ambas proteinas y que la tubulina era capaz de activar a la HL-Like1 in vitro.